何 嬌，羅陸僑，廖集琴

原位雜交和免疫組化雙染技術是在不同層次來檢測同一細胞上某些物質的表達是否有相關性的一種實驗方法。由于操作步驟復雜，實驗不易取得理想效果。我科結合本實驗室實際情況，經過反復摸索，獲得滿意效果，現(xiàn)將我科經驗總結如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集廣東省人民醫(yī)院病理科2019年1～5月EBER陽性病例16例，其中NK/T淋巴瘤 8例，Burkitt淋巴瘤2例，血管免疫母細胞性淋巴瘤4例，漿母細胞性淋巴瘤1例，淋巴結外周T細胞淋巴瘤1例。所有標本均及時固定及規(guī)范化取材，經10%中性福爾馬林固定。

1.2 試劑EBER原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋公司，AP免疫組化試劑盒購自徠卡公司，CD3、CD20一抗購自上海基因公司。

1.3 方法

1.3.1預實驗1 將組織連續(xù)4 μm厚切片4張，65 ℃烤片1 h，根據(jù)酶消化時間不同分為4個實驗組(表1)，先進行EBER原位雜交單染。

表1 預實驗1方法及結果

1.3.2預實驗2 根據(jù)預實驗1結果，選取胃酶消化12 min和16 min，再將實驗分為8組(表2)，進行第二步免疫組化染色。

表2 預實驗2方法及結果

1.3.3原位雜交和免疫組化雙染 根據(jù)預實驗1和預實驗2的染色結果，實驗條件有所改進：(1)切片脫蠟，無水乙醇洗3次，每次4 min，空氣中干燥切片。(2)滴加胃酶消化12 min，95%乙醇洗4 min，無水乙醇洗4 min，空氣中干燥切片。(3)滴加EBER探針，加蓋玻片，置于37 °C恒溫水浴箱中孵育3 h，揭開蓋玻片，PBS洗2次，每次4 min。(4)滴加地高辛二抗，室溫孵育30 min，PBS洗2次，每次4 min，DAB顯色5 min，PBS洗3 min。(5)免疫組化檢測在Leica Bond Ⅲ全自動免疫組化儀上進行，ER2修復12 min，PBS洗5 min×2。(6)一抗孵育55 min，PBS洗5 min×2。(7)Post primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2,Primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2。(8)快紅顯色10 min，蘇木精復染，干燥切片，中性樹膠封固。

1.4 判讀方法EBER原位雜交陽性為細胞核呈棕色，免疫組化陽性為胞膜呈紅色，雙染陽性者為同一細胞中細胞核呈棕色，細胞膜呈紅色。

2 結果

組織結構完整，EBER原位雜交陽性為細胞核呈棕色，免疫組化陽性為胞膜呈紅色，每個切片中均可見雙染陽性細胞，染色效果滿意(圖1、2)。

①②

3 討論

EBV屬于皰疹病毒，是傳染性單核細胞增多癥的原因，也與自身免疫病和多種腫瘤相關，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、毛細胞白血病和原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤[1]。在淋巴組織中，EBV可感染B、T及NK細胞，與其多種疾病有關[2]。EBV原位雜交法是檢測病理組織或細胞涂片中EBV病毒的常用檢測方法。原位雜交檢測EBER能夠定位EBV感染的細胞類型，是明確腫瘤與EBV相關的金標準[3]。但有時在淋巴瘤病理診斷中，單純性原位雜交和單純性免疫組化的基礎上難以精準判讀EBV陽性細胞的種系，給診斷帶來一定的困難。此時應用雙染技術，可以在同一張切片上清晰地觀察到EBV陽性細胞是T淋巴細胞還是B淋巴細胞，有利于組織學判讀，從而更加容易做出明確診斷[4]。

酶消化是原位雜交檢測成功與否的關鍵步驟。其目的是去除靶核酸周圍的蛋白質，增加組織的通透性，暴露靶基因，有利于探針滲透，增強雜交信號強度[5]。在單純性的EBER原位雜交檢測中，試劑盒推薦的酶消化時間為30 min，但作者發(fā)現(xiàn)，在EBER原位雜交和免疫組化雙染實驗中，如果先消化30 min后免疫組化再稍加修復，免疫組化染色大部分沒信號或信號極弱，細胞結構往往不完整，呈修復過度狀態(tài)；如果免疫組化不修復，細胞結構比較完好，但免疫組化染色太弱或沒信號，達不到染色要求。經過反復摸索，作者首先就不同的酶消化時間對EBER原位雜交結果的影響進行比較，發(fā)現(xiàn)酶消化12、16、20 min，EBER原位雜交染色信號均夠強，背景干凈，達到染色要求。

在預實驗2中，雙染中的免疫組化在全自動免疫組化儀上完成，操作簡單，縮短了檢測時間。由于第一步原位雜交中組織已經過一次預處理，相比免疫組化單染，雙染中的免疫組化只能采用較短的修復時間，才能既保證細胞結構完好，又能取得滿意的免疫組化染色結果。

檢測中還需注意以下幾點：(1)切片脫蠟后，經無水乙醇洗去二甲苯即可，無需經低濃度乙醇，酶消化前需干燥切片，防止有水稀釋酶的濃度。(2)EBER探針可在37 ℃水浴箱孵育3 h或在室溫孵育過夜，可以取得相同的效果。在實際工作中可以根據(jù)實際情況選擇時間。(3)相比免疫組化單染，免疫組化雙染檢測中一抗的濃度需要更高，孵育時間更長，以增加抗原抗體的結合。(4)中性樹膠中含有二甲苯會導致紅色顯色劑褪色，封片后應盡早采圖，防止顯色時間過長而褪色。