眭玉霞，鄧曉宇，伍 錚，林雅婷，張潤(rùn)民，郝昌鵬，陳靈鋒，王麗萍，晉 龍

肺癌的發(fā)病率與病死率居惡性腫瘤之首，遺傳學(xué)上具有較高的異質(zhì)性[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的80%～85%[2]。雖然臨床治療在傳統(tǒng)手術(shù)和放、化療聯(lián)合治療上已有很大改進(jìn)，但總體療效不佳，預(yù)后較差[3]。近十年來隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展和驅(qū)動(dòng)基因研究的逐步深入，NSCLC的診斷和治療發(fā)生了重大變革。多項(xiàng)研究表明，針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療在晚期NSCLC患者的治療和預(yù)后方面產(chǎn)生了革命性的影響，驅(qū)動(dòng)基因是靶向治療療效的重要預(yù)測(cè)因子。本實(shí)驗(yàn)擬通過分析NSCLC中驅(qū)動(dòng)基因(EGFR、KRAS、PIK3CA、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2和MET)的突變及與臨床病理特征的相關(guān)性，旨在為推動(dòng)多基因聯(lián)合檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本 選取福建省立醫(yī)院2013年4月～2017年1月收治的病理資料完整的550例原發(fā)性NSCLC作為研究對(duì)象。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片及HE染色，由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行重新審閱，依據(jù)WHO(2015)肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型，并確定有足夠的腫瘤細(xì)胞再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.1.2儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器采用安捷倫科技公司的熒光定量PCR儀(Mx3000P美國(guó))、Illumina NextSeq 500。福爾馬林固定石蠟包埋樣本DNA/RNA共分離試劑盒及人類EGRF、KRAS、PIK3CA、ALK、RET、ROS1、NRAS、BRAF、HER-2和MET突變基因檢測(cè)試劑、人類癌癥多基因突變聯(lián)合試劑盒(可逆末端終止測(cè)序法)均由廈門艾德生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1組織DNA和RNA的提取 用二甲苯及75%乙醇擦拭刀片、切片機(jī)刀座、鑷子，保證無交叉污染，切取3張5 μm厚石蠟包埋組織樣品，置于1.5 mL EP管內(nèi)，二甲苯脫蠟后用甲醇固定石蠟包埋樣本DNA/RNA共分離試劑盒提取基因組DNA和細(xì)胞總RNA。DNA和RNA分離完畢后，使用Nanodrop 2000測(cè)定DNA和RNA的濃度，DNA和RNA的A260/A280均介于1.8～2.1之間。

1.2.2蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)熒光定量PCR 使用廈門艾德生物公司的測(cè)試實(shí)際盒，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)條件：第一階段42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；第二階段95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10個(gè)循環(huán)；第三階段93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：第三階段60 ℃時(shí)收集FAM和HEX信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR。

1.2.3二代測(cè)序法 采用艾德生物公司的人類癌癥多基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(可逆末端終止測(cè)序法)，根據(jù)試劑盒說明操作：文庫(kù)建構(gòu)(打斷、片段篩選、末端修復(fù)、接頭連接、接頭連接后純化、文庫(kù)擴(kuò)增、文庫(kù)純化、文庫(kù)質(zhì)控)、雜交捕獲(試劑準(zhǔn)備、蒸干、雜交、捕獲、洗滌、擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲、擴(kuò)增后純化、捕獲產(chǎn)物質(zhì)控)、NextSeq上機(jī)、使用廈門艾德人類癌癥多基因突變聯(lián)合檢測(cè)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。陽(yáng)性判斷值：平均原始深度應(yīng)大于10 000×，平均有效深度大于500×，突變比例不低于0.4%，突變絕對(duì)拷貝數(shù)不低于2，鏈平衡性介于0.1～10之間，同時(shí)滿足以上條件時(shí)判斷為陽(yáng)性。

1.2.4整理病理資料 將所有患者的病理資料進(jìn)行分類整理，包括一般情況(年齡、性別、吸煙史)和臨床病理(病理組織學(xué)類型、位置分型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特征的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)550例原發(fā)性NSCLC中，患者年齡23～89歲，中位年齡62歲，平均61歲。男性295例，女性255例，男女比為1.16 ∶1。驅(qū)動(dòng)基因突變總發(fā)生率為73.6%(405/550)，分別為EGFR 57.3%(315/550)、KRAS 5.8%(32/550)、PIK3CA 2.2%(12/550)、ALK 3.8%(21/550)、RET 2.0%(11/550)、ROS1 1.1%(6/550)、NRAS 0.2%(1/550)、BRAF 1.5%(8/550)、HER-2 2.0%(11/550)和MET 0.3%(1/366)(圖1)。腺癌(P<0.001)、女性(P<0.001)、非吸煙史(P<0.001)、位置亞型為周圍型(P<0.001)以及形態(tài)學(xué)亞型以腺泡型為主(P=0.021)的腺癌患者較易發(fā)生驅(qū)動(dòng)基因突變(表1)。

圖1 肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變分布

2.2 聯(lián)合突變特點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)12例聯(lián)合突變患者及8例EGFR雙位點(diǎn)突變患者，突變率分別為2.2%(12/550)和1.5%(8/550)。在聯(lián)合突變中有11例合并EGFR突變，分別為EGFR與PIK3CA聯(lián)合突變6例，EGFR與KRAS聯(lián)合突變2例，EGFR與KRAS和PIK3CA三基因聯(lián)合突變1例，EGFR與ROS1聯(lián)合突變和EGFR與BRAF聯(lián)合突變各1例。還有1例為RET與HER-2聯(lián)合突變。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)EFGR與PIK3CA聯(lián)合突變樣本，發(fā)現(xiàn)該聯(lián)合突變更易發(fā)生在臨床分期較高(P=0.034)的患者中，且有1例為胎兒型腺癌。在EGFR雙位點(diǎn)突變的統(tǒng)計(jì)中顯示，EGFR雙位點(diǎn)突變多發(fā)于以乳頭型為主的腺癌(P=0.005)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.022)者中(表1)。

2.3 NSCLC中EGFR突變與臨床病理特征的關(guān)系EGFR突變更容易發(fā)生在女性(P<0.001)、無吸煙史(P<0.001)、腺癌(P<0.001)、周圍型(P<0.001)和以腺泡型為主的腺癌患者中(P=0.048)，少見于以實(shí)體型和黏液型為主的腺癌(P<0.001，表1)。

表1 NSCLC中驅(qū)動(dòng)基因總突變、EGFR突變、聯(lián)合PIK3CA突變及EGFR雙位點(diǎn)突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 NSCLC中KRAS突變與臨床病理特征的關(guān)系KRAS突變易發(fā)生于有吸煙史(P=0.006)的男性(P=0.043)患者。KRAS突變率在以浸潤(rùn)黏液型為主的腺癌中更高(P=0.008),而不易發(fā)生在以貼壁型為主的腺癌患者中(P=0.010，表2)。

2.5 NSCLC中PIK3CA突變與臨床病理特征的關(guān)系在PIK3CA突變患者中男性患者的突變率比女性更高(P=0.042)；與其他病理特征無明顯相關(guān)性(表2)。

2.6 NSCLC中ALK、RET和ROS1融合基因突變與臨床病理特征的關(guān)系在550例NSCLC中，融合基因總陽(yáng)性檢出率為6.9%(38/550)，其中ALK突變較容易發(fā)生在以實(shí)體型為主的腺癌(P=0.035)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.008)的患者中，貼壁型腺癌患者不易發(fā)生此基因突變(P=0.034)。ALK在<62歲的患者較多(P=0.117),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RET陽(yáng)性率為2.0%(11/550)，也較容易發(fā)生在以實(shí)體型為主(P=0.030)的腺癌中(表2)。ROS1陽(yáng)性率為1.1%(6/550)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其與臨床病理均無明顯相關(guān)性。

表2 NSCLC中KRAS、PIK3CA、ALK、RET基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.7 NSCLC中NRAS、BRAF、HER-2、MET突變與臨床病理特征的關(guān)系在550例NSCLC中有NRAS、BRAF、HER-2、MET基因突變患者均為腺癌、非吸煙且位置分型為周圍型的患者，多有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

在過去10年間，有關(guān)NSCLC驅(qū)動(dòng)基因的研究取得了明顯進(jìn)步，尤其在肺腺癌中約60%的驅(qū)動(dòng)基因被確定，肺鱗癌驅(qū)動(dòng)基因的檢出率也在逐步提高[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC常見的10種驅(qū)動(dòng)基因總突變率為73.6%。驅(qū)動(dòng)基因突變易發(fā)生在腺癌、女性、不吸煙且組織學(xué)形態(tài)以腺泡型為主的患者中，與既往研究報(bào)道一致[5]。

本實(shí)驗(yàn)中EGFR突變率為57.3%，在所有驅(qū)動(dòng)基因中占比最高，與國(guó)外報(bào)道較一致[6]。EGFR基因突變多見于女性、非吸煙及周圍型的肺腺癌患者，而與年齡及腫瘤分期無關(guān)。這與本組前期報(bào)道[7]結(jié)果相一致。根據(jù)中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)原發(fā)性肺癌診療指南(2018)的相關(guān)建議，所有含腺癌成分的NSCLC，無論其臨床特征，應(yīng)常規(guī)行EGFR突變/ALK融合突變檢測(cè)[8]。在組織學(xué)亞型的相關(guān)性研究中，EGFR在以腺泡型為主型的肺腺癌中較易發(fā)生突變，而在以黏液型和實(shí)體型為主型的肺腺癌中較少見，這與本組前期的研究[9]結(jié)論一致。

本組中KRAS基因突變率為5.8%，全部為肺腺癌患者，KRAS基因突變與吸煙史密切相關(guān)，男性突變率高于女性，與黃清潔等[10]研究相符。KRAS基因突變易發(fā)生于以黏液型為主的腺癌中，且不易發(fā)生在以貼壁型為主的腺癌中，與本組前期報(bào)道[9]相似。既往研究認(rèn)為NSCLC中KRAS與EGFR、BRAF、HER-2突變和ALK、ROS1重排是相互排斥的，但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3例標(biāo)本同時(shí)存在KRAS和EGFR基因突變，其中1例還聯(lián)合有PIK3CA基因突變，表明KRAS基因可與其它驅(qū)動(dòng)基因同時(shí)突變。

文獻(xiàn)報(bào)道PIK3CA在NSCLC中的突變率為2%～5%，可與EGFR等驅(qū)動(dòng)基因同時(shí)發(fā)生。本組PIK3CA突變率為2.2%，男性突變率大于女性。在本實(shí)驗(yàn)中未見PIK3CA在腺癌突變率低于鱗癌突變率的情況，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，這可能與本組中鱗癌例數(shù)較少有關(guān)。PIK3CA突變與組織學(xué)亞型無關(guān)，與Li等[11]結(jié)論相同。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合突變病例中PIK3CA與EGFR聯(lián)合突變7例，且全部都為腺癌患者。提示PIK3CA與EGFR發(fā)生聯(lián)合突變的概率較高。

ALK、ROS1、RET融合基因突變病例更容易發(fā)生在以實(shí)體型為主型的腺癌中，與既往研究[12]一致。ALK重排更容易發(fā)生在<62歲，非吸煙腺癌患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與以往研究基本一致[13]。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較易發(fā)生ALK突變。RET重排與患者性別、年齡、吸煙情況、組織學(xué)類型及臨床分期無相關(guān)性，與既往研究[12]結(jié)論一致。以往文獻(xiàn)報(bào)道RET不與其它突變共存[14]，但本組發(fā)現(xiàn)1例RET合并HER-2共同突變，因此RET與其它驅(qū)動(dòng)基因并非完全排斥，只是概率較低。ROS1突變與臨床病理無相關(guān)性，與Cai等[15]研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)中NRAS、BRAF、HER-2和MET基因突變均發(fā)生于周圍型肺腺癌，與吸煙史、病理類型、臨床分期均無相關(guān)。本組中有1例存在NRAS基因突變，突變率為0.2%，年齡59歲、非吸煙、病理學(xué)分期Ⅲ期的女性周圍型腺癌患者。在肺癌中BRAF突變率較低，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到8例BRAF突變，突變率為1.5%，這與以往統(tǒng)計(jì)相符合[16]。HER-2基因突變率為2.0%，略高于以往文獻(xiàn)報(bào)道[17]。由于突變樣本例數(shù)太少，具體臨床意義仍需進(jìn)一步探討。本組366例NSCLC中，發(fā)現(xiàn)MET基因突變1例，突變率為0.3%，年齡82歲、病理學(xué)分期Ⅳ期的女性周圍型腺癌患者。本次統(tǒng)計(jì)中MET基因突變率低于以往文獻(xiàn)報(bào)道(4.4%)[17]，這有可能是由于本組病例較少或與MET突變具有地區(qū)差異有關(guān)。

以往研究多表明各驅(qū)動(dòng)基因突變之間獨(dú)立存在[18]，但隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)各驅(qū)動(dòng)基因之間可有共存突變。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12例驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合突變和8例EGFR雙位點(diǎn)突變，突變率分別為2.2%和1.5%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共存突變基因與臨床病理特征有相關(guān)性，在驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合突變中PIK3CA與EGFR聯(lián)合突變7例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，存在該聯(lián)合突變的病例有較高的臨床分期，提示PIKACA與EGFR聯(lián)合突變的腫瘤惡性程度更大。EGFR雙位點(diǎn)突變較易發(fā)生在乳頭型腺癌和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中。同時(shí)應(yīng)用多種靶向藥物治療可能使該組罕見肺癌患者受益。

綜上所述，NSCLC中EGFR、KRAS、ALK基因均存在較高的突變率，其它驅(qū)動(dòng)基因以及驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合突變的突變率雖然低，但臨床意義重大[19]。WHO(2015)肺癌分類中倡議：全面的分子圖譜對(duì)肺癌的檢查非常重要，肺癌中多分子改變的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)這些患者有潛在的臨床意義。因此，在治療初期對(duì)肺癌患者進(jìn)行多基因聯(lián)合檢測(cè)，有利于臨床上加快篩選有效目標(biāo)人群，使患者接受個(gè)體化的針對(duì)性治療，提高治療效果，在臨床治療上具有重要意義。