何 巖，吳春磊，李澤宇，宋偉航，李建昌，竇啟鋒

前列腺癌起源于前列腺上皮細(xì)胞，是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，在西方國(guó)家男性惡性腫瘤中其發(fā)病率占首位，在我國(guó)男性惡性腫瘤中的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)[1]。探討前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，已成為前列腺癌防治研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是一類(lèi)缺乏開(kāi)放閱讀框的單鏈RNA分子，由于不能編碼蛋白，lncRNA一直被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能[2]。近年來(lái)研究證實(shí)，大量lncRNA在多種腫瘤中表達(dá)異常，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管形成、化療耐藥、放療敏感性等生物學(xué)行為，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。隨著對(duì)lncRNA的研究，其在前列腺癌細(xì)胞中的作用逐漸被明確，有望成為前列腺癌早期診斷的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[5]。UG0898H09是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腫瘤中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)前列腺癌組織及細(xì)胞株中UG0898H09的表達(dá)，明確UG0898H09與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，觀察上調(diào)UG0898H09對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，初步探討UG0898H09在前列腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年2月～2019年10月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科存檔的手術(shù)切除前列腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織53例，術(shù)后標(biāo)本均由本院病理科資深醫(yī)師確診，于液氮中冷凍保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，，患者均簽署知情同意書(shū)。人前列腺癌細(xì)胞株(PC-3、C4-2B、LNCaP、PC-3M和DU-145)及正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)購(gòu)于美國(guó)ATCC公司；表達(dá)UG0898H09的質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒和PCR引物購(gòu)于廣州瑞博生物公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和WST-1細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；一抗α-Tubulin、KLF4、Cyclin H、CDK7、N-cadherin和ZEB-1均購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基中，前列腺癌細(xì)胞株(PC-3、C4-2B、LNCaP、PC-3M和DU-145)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LNCaP細(xì)胞胰酶消化傳代后，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板，按照隨機(jī)數(shù)字法分為陰性對(duì)照組和UG0898H09組。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒(陰性對(duì)照組)和表達(dá)UG0898H09的質(zhì)粒(UG0898H09組)。

1.3 qRT-PCR法使用Trizol試劑盒提取組織和細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參比較UG0898H09和KLF4 mRNA的表達(dá)，以U6為內(nèi)參比較miR-511-5p的表達(dá)。UG0898H09引物序列：上游5′-GCAGCTGCAGAAAGACACCT-3′，下游5′-ATGCTCAGACCCAAGCAGAG-3′。GAPDH引物序列：上游5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3′。miR-511-5p引物序列：上游5′-CACTCAGCCTTGAGGGC-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。KLF4引物序列：上游5′-CAGCTTCACCTATCCGATCCG-3′，下游5′- GACTCCCTGCCATAGAGGAGG-3′。qRT-PCR條件為95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。UG0898H09、miR-511-5p和KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。每組均設(shè)置4個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。

1.4 WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組LNCaP細(xì)胞，重懸細(xì)胞后以4×103個(gè)/孔接種于96孔板，分別于培養(yǎng)第1、2、3、4、5天采用WST-1細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。檢測(cè)時(shí)，每孔加入WST-1試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每組均設(shè)置4個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組LNCaP細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6孔板(接種細(xì)胞量以次日鋪滿培養(yǎng)板一層為宜)。接種24 h后，采用200 μL槍頭在6孔板中劃痕，PBS洗3次，分別于劃痕后0 h和24 h觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照，計(jì)算遷移率=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。每組均設(shè)置4個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。

1.6 生物信息學(xué)技術(shù)分析UG0898H09的靶基因采用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0分析UG0898H09可互補(bǔ)結(jié)合的miRNA。采用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRecords分析可互補(bǔ)結(jié)合的mRNA。

1.7 Western blot法收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組LNCaP細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用10%SDS-PAGE膠電泳，行硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶在室溫下封閉，加入一抗α-Tubulin(1 ∶2 000稀釋)、KLF4(1 ∶1 000稀釋)、Cyclin H(1 ∶2 000稀釋)、CDK7(1 ∶3 000稀釋)、N-cadherin(1 ∶2 000稀釋)和ZEB-1(1 ∶1 000稀釋)，于4 ℃下孵育24 h，加入二抗在室溫下孵育，采用ECL發(fā)光液在成像系統(tǒng)顯影并拍照。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中UG0898H09的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)顯示UG0898H09在前列腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量分別為1.19±0.34和4.99±0.73，UG0898H09在前列腺癌組織中的表達(dá)下調(diào)(t=47.07，P<0.01，圖1)，提示UG0898H09可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖1 前列腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中UG0898H09的表達(dá)：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 UG0898H09在不同前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)顯示UG0898H09在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、LNCaP、C4-2B、PC-3M、DU-145和正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中表達(dá)量分別為0.80±0.04、0.17±0.03、0.43±0.01、0.72±0.03、0.50±0.04和1.00±0.05，UG0898H09在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào)(P<0.05，圖2)。UG0898H09在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)量最低(P<0.01)，選擇LNCaP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 UG0898H09在正常前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)：與RWPE-1細(xì)胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率陰性對(duì)照組和UG0898H09組LNCaP細(xì)胞中UG0898H09的表達(dá)量分別為1.02±0.11和8.93 ± 0.56，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.4 WST-1法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染UG0898H09后的第2天LNCaP細(xì)胞增殖能力開(kāi)始下降，提示UG0898H09可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖能力(P<0.05，圖3)。

圖3 WST-1法檢測(cè)各組LNCaP細(xì)胞增殖能力：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力陰性對(duì)照組和UG0898H09組細(xì)胞的遷移率分別為(72.44±3.93)%和(43.83±7.11)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，UG0898H09可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的遷移能力(圖4)。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組LNCaP細(xì)胞遷移能力

2.6 生物信息學(xué)技術(shù)分析UG0898H09的靶基因采用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0分析，UG0898H09可互補(bǔ)結(jié)合miR-511-5p。采用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRecords分析，miR-511-5p可互補(bǔ)結(jié)合KLF4 mRNA(圖5)。

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)分析UG0898H09的靶基因

2.7 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-511-5p和KLF4 mRNA的表達(dá)陰性對(duì)照組和UG0898H09組LNCaP細(xì)胞中miR-511-5p的表達(dá)量分別為1.01±0.07和0.32±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陰性對(duì)照組和UG0898H09組LNCaP細(xì)胞中KLF4 mRNA的表達(dá)量分別為1.01±0.10和4.71±0.84，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.8 Western blot法檢測(cè)KLF4和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，UG0898H09組KLF4蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK7和Cyclin H表達(dá)明顯降低，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin和ZEB-1表達(dá)明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組LNCaP細(xì)胞KLF4蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

lncRNA屬于非編碼RNA家族成員，是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本[6-7]。lncRNA參與調(diào)控染色體組裝，可在轉(zhuǎn)錄層面和轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)控基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞的各種生理病理過(guò)程[8-9]。已有大量研究證實(shí)lncRNA在前列腺癌中出現(xiàn)特異性表達(dá)，具有癌基因或抑癌基因作用，在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。例如lncRNA CASC15、SNHG20和MIR4435-2HG在前列腺癌組織和細(xì)胞株中呈高表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，可顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11-13]。UG0898H09是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腫瘤特別是前列腺癌中的作用機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與癌旁組織或正常前列腺上皮細(xì)胞相比，UG0898H09在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，提示UG0898H09顯著下調(diào)可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在LNCaP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)UG0898H09，細(xì)胞的增殖和遷移能力均被顯著抑制，提示UG0898H09在前列腺癌細(xì)胞中起著抑癌基因作用。已有研究證實(shí)，lncRNA可通過(guò)“海綿作用”與微小RNA(miRNA)反應(yīng)元件競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制miRNA與靶基因信使RNA(mRNA)的結(jié)合，從而降低miRNA的RNA干擾作用，促進(jìn)靶基因的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0發(fā)現(xiàn)，UG0898H09可配對(duì)結(jié)合miR-511-5p。有研究表明，miR-511-5p在肝癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)miR-511-5p表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，miR-511-5p發(fā)揮癌基因作用[15]。本實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)UG0898H09后，miR-511-5p表達(dá)降低，UG0898H09可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-511-5p。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站miRecords發(fā)現(xiàn)，miR-511-5p可配對(duì)結(jié)合KLF4 mRNA。KLF4基因位于9q31染色體，KLF4蛋白是鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF家族成員，廣泛表達(dá)于人體組織，在細(xì)胞的各種生理活動(dòng)中具有重要調(diào)節(jié)作用[16]。已有研究證實(shí)，KLF4蛋白在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[17-19]。miR-511-5p表達(dá)降低后，KLF4 mRNA表達(dá)增加，表明UG0898H09可能通過(guò)吸附miR-511-5p，促進(jìn)KLF4基因表達(dá)。Western blot法檢測(cè)顯示，KLF4蛋白表達(dá)上調(diào)后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK7和Cyclin H的表達(dá)減少，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin和ZEB-1表達(dá)減少，進(jìn)一步證實(shí)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)lncRNA UG0898H09在前列腺癌組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá)，上調(diào)UG0898H09可通過(guò)miRNA海綿作用負(fù)向調(diào)控miR-511-5p表達(dá)，促進(jìn)KLF4基因表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。UG0898H09有望成為前列腺癌潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。