洪 楊，胡 沁，李曉靜，馬恩蘭，郭欣欣，侯英勇，宿杰·阿克蘇

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其病死率較高[1-2]，流行病學(xué)研究顯示人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)存在于99%的子宮頸癌中[3]，子宮頸癌的發(fā)病時間較長，從癌前病變開始可達(dá)10～30年[4]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是預(yù)防子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要手段。市場上HPV的檢測方法原理及特點均有所不同，其中獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的方法僅有4種：Digene HC2 HPV HR test、Cervista HPV HR test、Cobas 4800 HPV test、Aptima HPV[5]。由于其檢測HPV操作步驟多而繁瑣、檢測成本高、不能具體分型每一種感染HPV型別等缺點，限制了其在臨床常規(guī)檢測中的廣泛應(yīng)用。不同HPV高危亞型在各類人群中的致癌能力是否不同，使HPV分型檢測得到越來越多關(guān)注。本實驗比較的qRT-PCR法、反向斑點雜交法和流式熒光法均經(jīng)FDA批準(zhǔn)，是國內(nèi)現(xiàn)有較常見的HPV分型檢測平臺，通過比較不同HPV檢測平臺特點及結(jié)果的差異性，為臨床選擇HPV檢測方法提供參考依據(jù)。

1.1 材料收集2018年5月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行HPV檢測的800例子宮頸細(xì)胞標(biāo)本，年齡20～68歲，使用無菌細(xì)胞學(xué)采樣刷，順時針旋轉(zhuǎn)3～5周刷取子宮頸鱗柱交界處脫落細(xì)胞，將收集的細(xì)胞保存于ThinPrep細(xì)胞保存液(HOLOGIC，美國)中。

1.2 HPV檢測將所有送檢標(biāo)本先留取4 mL用于不同平臺HPV對比實驗，其余標(biāo)本進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測。

1.2.1qRT-PCR 留取的4 mL樣本中的1 mL均先用qRT-PCR試劑盒(上海之江生物公司)對15種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)進(jìn)行分型檢測，操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：以循環(huán)閾值(Ct值)來標(biāo)記病毒負(fù)荷量，Ct值按如下公式計算，Ct=Ct標(biāo)本-Ct內(nèi)參照+28，其中內(nèi)參照為人單拷貝基因MNBH；若Ct≤38.0且擴增曲線呈典型的S型，則判定為HPV陽性。所有的陽性病例(68例)和簡單隨機抽樣法抽取的陰性病例(22例)再用流式熒光法分型檢測試劑盒(上海透景公司)和反向斑點雜交法分型檢測試劑盒(北京博暉公司)進(jìn)行檢測。

1.2.2反向斑點雜交法 留取的4 mL樣本中的1 mL對18種高危型HPV(前15種加53、73、83)和6種低危型HPV(6、11、42、43、44、81)進(jìn)行分型檢測，操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：雜交膜的SP點(3個)均有陽性斑點，內(nèi)參質(zhì)控點(3個)有陽性斑點，且有HPV探針陽性斑點出現(xiàn)，提示樣本為該探針對應(yīng)亞型陽性。

1.2.3流式熒光法 留取的4 mL樣本中的1 mL對17種高危型HPV(前15種加53、26)和10種低危型(前6種加40、83、55、61)進(jìn)行分型檢測，操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：陽性內(nèi)對照Globin的信號﹥150，任何HPV型別特異性探針的信號﹥150則判定該探針對應(yīng)的型別為陽性。

1.3 HPV基因測序三種HPV檢測平臺結(jié)果不一致時，則對樣本進(jìn)行HPV DNA的一代測序。樣本來源于留取的4 mL樣本中的1 mL。測序工作委托上海之江生物公司采用3730XL測序儀(ABI，美國)進(jìn)行。

1.4 液基細(xì)胞學(xué)檢測所有病例均進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測，本實驗獲得的液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果報告采用TBS分級報告系統(tǒng)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算每種HPV型別檢測結(jié)果的Kappa指數(shù)(Kappa index, KI)，KI≥0.75定義為一致性極好，0.4

2 結(jié)果

2.1 不同HPV型別感染率的比較以一代測序結(jié)果為參照，統(tǒng)計標(biāo)本15種高危型HPV的感染率，感染率為7.125%(57/800)，感染率型別前三的分別為HPV 52、16、58型(圖1)。

圖1 高危型HPV陽性標(biāo)本型別及對應(yīng)感染率

2.2 每種型別HPV檢測結(jié)果的一致性比較qRT-PCR與反向斑點雜交法結(jié)果一致性良好及以上為100%；qRT-PCR與流式熒光法結(jié)果一致性良好及以上為86.7%；流式熒光法與反向斑點雜交法結(jié)果一致性良好及以上為80%(表1)。

表1 三種平臺兩兩比較15種高危型HPV檢測結(jié)果一致性KI值

2.3 三種平臺HPV檢測結(jié)果與一代測序結(jié)果符合率比較由于有10例Ct值>36的樣本測序失敗，以一代測序結(jié)果作為參照，比較其余80例三種平臺檢測結(jié)果的符合率(表2)。qRT-PCR、反向斑點雜交法、流式熒光法的符合率分別為87.78%、94.45%、74.44%。qRT-PCR與反向斑點雜交法結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，流式熒光法與qRT-PCR、反向斑點雜交法結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：反向斑點雜交法和qRT-PCR法與一代測序結(jié)果符合率較高，qRT-PCR和反向斑點雜交法的靈敏度分別為96.6%和91.6%。

表2 三種平臺兩兩比較15種高危型HPV檢測結(jié)果符合率

3 討論

本文通過對15種高危型HPV感染率的統(tǒng)計得出，感染率前三位的分別是HPV 52、16、58型，與文獻(xiàn)報道[6]的結(jié)果基本一致。高危型HPV分型檢測在子宮頸癌及其癌前病變的篩查中具有指導(dǎo)意義[7]。本組通過對不同的HPV檢測平臺所得檢測結(jié)果進(jìn)行比較與分析，為探究最為準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法提供了依據(jù)，結(jié)果顯示：(1)qRT-PCR法和反向斑點雜交法的結(jié)果一致性最高，這與文獻(xiàn)[8-9]報道一致；(2)qRT-PCR法的靈敏性最高，反向斑點雜交法與一代測序結(jié)果符合率最高。這可能由以下兩方面原因所致：(1)一代測序的敏感度適中，低濃度的病毒載量無法檢出；(2)qRT-PCR法具有極高的靈敏性使得含量極低的靶基因亦可被檢測，而反向斑點雜交法敏感度適中，且一體成型不易交叉污染。比較三種平臺檢測特點，qRT-PCR法具有靈敏性高，操作簡單，用時較短的特點，可對病毒負(fù)載量進(jìn)行檢測，但受熒光通道的限制只能檢測15種高危型HPV。反向斑點雜交法具有操作簡單，特異性高，且實驗環(huán)境不受PCR實驗室分區(qū)限制的優(yōu)點，檢測結(jié)果定性不能定量。流式熒光法檢測的原理是利用微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物的緊密結(jié)合，其檢測的HPV型別種類最多，通量大，但同時操作步驟多，易引入人為誤差，檢測結(jié)果定性不能定量，本實驗結(jié)果顯示其檢測結(jié)果和一代測序符合率僅74.44%，與qRT-PCR、反向斑點雜交法檢測結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能因影響結(jié)合率的因素較多，使得無法保證百分之百的結(jié)合而影響檢測結(jié)果。三種檢測方法的實驗原理、引物、酶均不同，其檢測HPV基因型別有所不同，不同的引物探針對之間可能存在相互干擾，造成檢測結(jié)果存在一定的差異。

本實驗發(fā)現(xiàn)10例qRT-PCR檢測結(jié)果Ct值﹥36，而另兩種檢測平臺和一代測序均未測出，而液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果均為輕～中度炎癥，說明HPV敏感性過高可能并不具有很高的特異性，因此子宮頸癌的篩查方法并不推薦最敏感的方法。已有研究顯示僅有單獨HPV檢測的篩查增加了陽性結(jié)果和陰道鏡檢查的數(shù)量，而長期預(yù)后尚不確定[10]。研究表明，液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測可顯著提高子宮頸癌病變的陽性檢出率及特異性，減少過度治療的可能性[11]。本課題中組織學(xué)檢測病例樣本量相對較少，但入選病例為800例，樣本量相對較大，且三個不同平臺重復(fù)實驗，檢測結(jié)果互相驗證，所得結(jié)論與文獻(xiàn)報道一致，進(jìn)一步證明結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，qRT-PCR法和反向斑點雜交法的結(jié)果一致性最高，在臨床應(yīng)用上各有優(yōu)缺點，液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測可顯著提高子宮頸癌病變的陽性檢出率及特異性。今后的工作中可以結(jié)合病理組織活檢結(jié)果，擴大研究規(guī)模，并開展具有長期隨訪結(jié)果的前瞻性研究。