陳琛斌，黃群佳，謝旺凱，徐劍峰，沈賢，薛向陽(yáng)，趙志光

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病 毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035）

胃癌是全球高發(fā)病率的五大惡性腫瘤之一，也是造成中國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第二大常見(jiàn)原因[1]。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domain-associated protein，DAXX）最初被認(rèn)為是促凋亡蛋白[2]，可與Fas受體的死亡結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合[3]。我們前期的研究[4]發(fā)現(xiàn)，DAXX表達(dá)量的增加與胃黏膜的惡性表型相關(guān)，且在胃癌中存在較高的核/漿比值 （nucleus/cytoplasm ratio，NCR）。有研究顯示小泛素化修飾（small ubiquitin-like modification， SUMO）對(duì)DAXX的亞細(xì)胞定位及功能的調(diào)節(jié)具有重要意義[5]。但是，在胃癌中關(guān)于SUMO化修飾改變DAXX的核-漿定位，進(jìn)而影響胃癌惡性表型的相關(guān)研究，仍未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究旨在比較DAXX在胃癌組織中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位，及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并探討SUMO影響DAXX的細(xì)胞核-漿定位的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒：人胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901、MKN-45和永生化胃黏膜細(xì)胞系GES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/干細(xì)胞庫(kù)。pcDNA3.1-DAXX-HA重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并長(zhǎng)期保存于 -80 ℃冰箱，質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。

1.1.2 主要試劑：人脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；FBS、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，Western blot及細(xì)胞裂解液試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒以及PBS購(gòu)自上海碧云天生物研究所，RealMaster Mix試劑盒、ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司，SYBR Green PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連Takara公司，細(xì)胞核-漿分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。HA抗體、SUMO-2/3抗體、α-tubulin抗體和Lamin-A/C抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。DAXX的PCR引物由深圳華大基因科技有限公司合成，F(xiàn)P：5’-TGACC CAGACTCCGCATAC-3’，RP：5’-CCGAAGCACATCCCCATA-3’。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：回顧性收集2017年1月至6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院術(shù)后經(jīng)病理確診為胃癌的癌組織和癌旁組織（距離病灶＞2 cm范圍的組織），共20對(duì)。

1.2.2 生物信息學(xué)分析：分析DAXX基因在胃癌組織和癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平，以及DAXX和SUMO-2/3的表達(dá)分別與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)，分析DAXX的表達(dá)情況與SUMO-2/3之間的相關(guān)性。

1.2.3 免疫組化：石蠟切片脫蠟和水化，修復(fù)抗 原，滴加封閉液。滴加DAXX一抗。滴加二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，拍照、保存并采用Image-Pro Plus圖像軟件進(jìn)行半定量分析，分別記錄陽(yáng)性細(xì)胞核與漿的積分光密度（IOD）值與面積值。

1.2.4 RT-qPCR：參照TRIzol試劑使用說(shuō)明書(shū)，提取各胃癌細(xì)胞總RNA，使用DNA去除試劑盒去除DNA污染并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照RT-qPCR使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)mRNA含量。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：將胃癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的60%～70%時(shí)，將2 μg/孔的DAXX-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，操作按LipofectamineTM2000產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，同時(shí)分別設(shè)空載質(zhì)粒3.1作為陰性對(duì)照組，分別稱為DAXX組和空載質(zhì)粒組。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)：樣品經(jīng)SDS-PAGE膠分離后并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，37 ℃下5%脫脂牛奶封閉 0.5 h，分別加入一抗（兔抗HA標(biāo)簽抗體1:1 000、鼠抗DAXX 1:200、兔抗SUMO-2/3抗體1:1 000、鼠抗GAPDH 1:1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。于37 ℃加入二抗 （羊抗兔1:5 000），室溫孵育2 h；加入ECL顯色液后顯色并拍照。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)：以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板（100 μL/孔）中培養(yǎng)，鋪板12 h后轉(zhuǎn)染，空白孔調(diào)零。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（轉(zhuǎn)染后24、48、72 h），按說(shuō)明書(shū)要求加入CCK-8試劑，由酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值，比較各組細(xì)胞的增殖情況。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到6孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，每個(gè)孔用1 mL移液器槍頭劃線以形成2個(gè)線性區(qū)域，然后用培養(yǎng)基洗滌2次。隨后將具有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。分別在劃線0、24和48 h后，在顯微鏡下拍攝板的攝影圖像以檢測(cè)傷口愈合并進(jìn)行分析。

1.2.9 細(xì)胞免疫熒光：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞棄去原有培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛37 ℃孵育10 min，0.1% Triton X-100室溫下處理15 min。5%山羊血清封閉1 h，鼠抗HA抗體（1:200），4 ℃孵育過(guò)夜。FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體孵育1.0 h，加入 1 μg/mL DAPI于37 ℃下染色5 min。加入抗熒光淬滅劑并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10 細(xì)胞核-漿蛋白分離：收集轉(zhuǎn)染24 h后新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞，冰PBS洗滌2次。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞重懸于100～500 μL冰冷的細(xì)胞分級(jí)緩沖液中，孵育5～10 min，4 ℃和500×g下離心樣品 5 min。上清液為細(xì)胞漿蛋白；使用細(xì)胞破碎緩沖液重懸沉淀，得到細(xì)胞核蛋白。

圖1 DAXX在胃癌組織中的表達(dá)情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0和Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)性使用Person相關(guān)系數(shù)；分類變量以例（%）表示，2組間使用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。生存分析使用Kaplan-Meier方法，并采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAXX在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌組織和癌旁組織分析顯示，DAXX在胃癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。DAXX的表達(dá)高低對(duì)胃癌患者的生存預(yù)后無(wú)明顯影響（P=0.52），見(jiàn)圖1B。DAXX典型的免疫組化染色如圖1C中所示，13個(gè)GC組織中DAXX表達(dá)評(píng)分為陽(yáng)性（占總數(shù)的65.0%），10個(gè)相鄰正常組織（占總數(shù)的50.0%）顯示陽(yáng)性表達(dá)。同時(shí)，在DAXX表達(dá)陽(yáng)性的組織中，DAXX主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)（見(jiàn)圖1D），且胃癌組織的DAXX NCR值顯著高于正常組織中的DAXX NCR值（P＜0.01），見(jiàn)圖1E。

2.2 DAXX在人胃癌細(xì)胞系的表達(dá) 通過(guò)qRT-PCR在5個(gè)胃癌細(xì)胞系和永生化胃黏膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞中檢測(cè)了DAXX的mRNA表達(dá)水平（見(jiàn)圖2）。與GES-1相比，在檢測(cè)的5個(gè)GC細(xì)胞系中，BGC-823細(xì)胞中DAXX表達(dá)相對(duì)較高，而DAXX在SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)偏低?；谶@些結(jié)果，選擇BGC-823細(xì)胞系用于進(jìn)一步分析。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系中DAXX蛋白的mRNA表達(dá)

2.3 DAXX重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及蛋白表達(dá)的驗(yàn)證 以BGC-823細(xì)胞的cDNA為模板，含HA標(biāo)簽的DAXX全長(zhǎng)基因正向引物及反向引物擴(kuò)增DAXX基因，將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒中，經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證，成功構(gòu)建含有DAXX基因的重組質(zhì)粒（見(jiàn)圖3A）。將DAXX-HA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞24 h后，收集胃癌細(xì)胞的總蛋白，使用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞能夠表達(dá)DAXX蛋白，不含目的基因的對(duì)照質(zhì)粒未檢測(cè)到DAXX蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖3B）。免疫熒光結(jié)果顯示，DAXX蛋白可表達(dá)于胃癌細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞核中，且主要集中于細(xì)胞核內(nèi)（見(jiàn)圖3C）。

圖3 DAXX重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及蛋白表達(dá)

2.4 DAXX過(guò)表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞功能的影響 Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DAXX質(zhì)粒24 h后，較空載質(zhì)粒組相比，過(guò)表達(dá)后DAXX的含量增加1倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），說(shuō)明過(guò)表達(dá)成功（見(jiàn)圖4A）。隨后，轉(zhuǎn)染后第24、第48、第72 h進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，DAXX組BGC-823細(xì)胞增殖能力較空載質(zhì)粒組明顯降低（P＜0.05），提示過(guò)表達(dá)DAXX能抑制BGC-823細(xì)胞的增殖能力（見(jiàn)圖4B）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與空載質(zhì)粒組相比，過(guò)表達(dá)DAXX后BGC-823細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4C。

2.5 DAXX與SUMO2/3的相互作用 對(duì)于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)胃癌組織樣本，通過(guò)GEPIA分析顯示，DAXX轉(zhuǎn)錄水平與SUMO-2/3之間存在相關(guān)性（見(jiàn)圖5A-B）。同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后第24、第48、第72 h胃癌細(xì)胞的總蛋白，使用HA標(biāo)簽抗體和SUMO2/3抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證；結(jié)果顯示，DAXX組表達(dá)DAXX蛋白，空載質(zhì)粒組未檢測(cè)到DAXX蛋白表達(dá)，且DAXX組的SUMO修飾程度較空載質(zhì)粒組更多（見(jiàn)圖5C）。之后根據(jù)核-漿分離結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)DAXX后其漿蛋白明顯升高，DAXX組的NCR明顯低于空載質(zhì)粒組（P＜0.01），見(jiàn)圖5D-E。

3 討論

DAXX是一種除睪丸和胸腺外在人全身各器官均高表達(dá)的蛋白。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，DAXX的增多與胃黏膜的惡性表型相關(guān)，且高DAXX NCR的胃癌患者相對(duì)于低DAXX NCR的患者，其生存預(yù)后更差。本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫組化證實(shí)了DAXX在胃癌組織中高表達(dá)，DAXX NCR在胃癌組織中明顯高于其配對(duì)的癌旁正常組織。

由于轉(zhuǎn)錄后加工，DAXX以3種同種型存在，分子量分別為70、97和120 kDa。結(jié)構(gòu)和功能研究顯示，DAXX是一種高度保守的蛋白，并通過(guò)與早幼粒細(xì)胞白血病蛋白、Fas等多種蛋白結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮著重要作用[6-7]，但關(guān)于DAXX的功能目前尚未闡明完全。DAXX與Fas受體之間的相互作用表明DAXX在細(xì)胞質(zhì)中起作用，而其他報(bào)道表明DAXX主要位于細(xì)胞核[5，8]。有研究發(fā)現(xiàn)，DAXX既可以是促凋亡因子，也可以是抗細(xì)胞凋亡因子，主要取決于其在細(xì)胞中的亞定位變化[9]。DAXX最初被鑒定為細(xì)胞質(zhì)分子，其通過(guò)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）將Fas信號(hào)傳導(dǎo)與JNK途徑聯(lián)系起來(lái)[3]。除了在細(xì)胞質(zhì)中的作用外，DAXX還可作為核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共抑制因子，抑制多種蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的活性，包括ETS1、Pax3、糖皮質(zhì)激素受體（GR）和p53[10]。在腫瘤細(xì)胞中，DAXX主要位于細(xì)胞核中，被認(rèn)為是促癌因子。HORVILLEUR等[11]研究發(fā)現(xiàn)，具有高DAXX表達(dá)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后較差。據(jù)報(bào)道，DAXX通過(guò)激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌腹水細(xì)胞增殖和遷移[12]，但在胃癌中尚未見(jiàn)關(guān)于DAXX的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)性的報(bào)道。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各胃癌細(xì)胞系中DAXX的mRNA表達(dá)水平，挑選其中表達(dá)量最高的BGC-823細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建DAXX-HA的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后DAXX的過(guò)表達(dá)效果顯著，并且通過(guò)免疫熒光顯示其主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；使用CCK-8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，證實(shí)了過(guò)表達(dá)DAXX能抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖能力和促進(jìn)其遷移能力，這與之前的研究報(bào)道基本一致。

圖5 DAXX可能通過(guò)與SUMO-2/3作用調(diào)節(jié)核-漿定位

DAXX的亞細(xì)胞定位決定了它的功能，而DAXX的亞細(xì)胞定位與小泛素相關(guān)修飾蛋白（Small ubiquitin-related modifier，SUMO）關(guān)系十分密切。SUMO是一種與泛素類似的多肽分子，由98個(gè)氨基酸組成，廣泛存在于真核生物中，其存在4個(gè)同源異構(gòu)體：SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。其中，SUMO-2/3主要修飾應(yīng)激狀態(tài)下的蛋白[13]。SUMO調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核轉(zhuǎn)運(yùn)、基因組不穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄[6，14]。據(jù)報(bào)道，DAXX通過(guò)SUMO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞表型。本研究使用DAXX-HA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)24、48和72 h的SUMO2/3表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)，與空載質(zhì)粒組相比，DAXX組的SUMO水平明顯升高；而在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，DAXX的SUMO水平逐漸降低。研究報(bào)道顯示，SUMO2/3修飾可促進(jìn)核漿轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，過(guò)表達(dá)DAXX后NCR的降低，引起細(xì)胞增殖能力的下降，與之前研究中免疫組化的發(fā)現(xiàn)相一致[4]。因此，本研究認(rèn)為，DAXX可能通過(guò)與SUMO2/3結(jié)合發(fā)生SUMO，促進(jìn)DAXX從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，DAXX在胃癌組織高表達(dá)，而且DAXX在胃癌細(xì)胞的核中表達(dá)量較高。過(guò)表達(dá)DAXX可能通過(guò)SUMO促進(jìn)細(xì)胞核-漿轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制BGC-823腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞遷移，提示DAXX在細(xì)胞核內(nèi)的高表達(dá)可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素。胃癌細(xì)胞中導(dǎo)致DAXX的SUMO具體機(jī)制，將是我們未來(lái)研究的方向。