周功挺，王繼生，陳亦明，洪重，廖毅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325027）

以吉西他濱（gemcitabine，GEM）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎(chǔ)的兩大類方案對(duì)治療膽管癌延長(zhǎng)生存時(shí)間取得了一定的效果，但對(duì)抑制腫瘤的復(fù)發(fā)及進(jìn)展作用有限，且不良反應(yīng)較大，目前GEM耐藥已成為導(dǎo)致其療效不佳的重要原因[1-2]。 缺乏有效敏感的化療藥物及合理的化療方案是膽管癌綜合治療的瓶頸。JAK/STAT3在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其在腫瘤中的激活影響細(xì)胞增殖、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成的多種信號(hào)通路，被認(rèn)為是腫瘤治療的靶點(diǎn)[3-5]。研究結(jié)果表明隱丹參酮是一種有效的STAT3抑制劑，可有效抑制STAT3 Tyr705磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[6-8]，可增強(qiáng)紫杉醇對(duì)舌鱗癌細(xì)胞毒性作用[9]，逆轉(zhuǎn)人肺癌A549細(xì)胞順鉑耐藥等[7]。

然而，目前仍不清楚隱丹參酮是否能增強(qiáng)膽管癌吉西他濱化療的作用。因此，本研究探討隱丹參酮與吉西他濱聯(lián)合用藥對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞株的體外凋亡及周期的影響，并探討STAT3在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA緩沖液等免疫印跡試劑購(gòu)自上海碧云天公司；吉西他濱購(gòu)自美國(guó)禮來(lái)公司；隱丹參酮粉劑（批號(hào)：S228530）購(gòu)于美國(guó)Selleck公司，純度＞99%，溶于DMSO中，配制成10 mmol/L 的儲(chǔ)存液，于-20 ℃保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

1.1.2 抗體：STAT3、pSAT3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，Bcl-2、Bax購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，cyclin D蛋白抗體購(gòu)自武漢三鷹公司，β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人膽管癌QBC939細(xì)胞（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）培養(yǎng)在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，每3 d換液1次。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，約80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌QBC939細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液， 以細(xì)胞數(shù)4×103/孔分別接種到96孔板。細(xì)胞貼壁 后，分別加入用完全培養(yǎng)基配制的連續(xù)濃度的隱丹參酮處理（0、10、20、30、40和50 μmol/L），分別加 入用完全培養(yǎng)基配制的連續(xù)濃度吉西他濱100 μL（分 別為0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/mL），持續(xù)24和48 h。藥物作用結(jié)束前1 h，各孔加入0.01 mL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀（Bio-Tek，ELX800）測(cè)定吸收度（A450），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率＝[1-藥物組A570 nm/對(duì)照組A570 nm]× 100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。隱丹參酮和吉西他濱的實(shí)驗(yàn)濃度參考CCK-8實(shí)驗(yàn)確定的48 h的IC50。經(jīng)對(duì)照組培養(yǎng)基、隱丹參酮20 μmol/L、吉西他濱2 μg/mL及聯(lián)合用藥組（隱丹參酮10 μmol/L+ 吉西他濱1 μg/mL）處理24 h后，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，取1 mL于1 000 r/min共離心5 min，棄去上清液，用PBS漂洗1次后，加入Annexin V binding buffer 500 μL混勻，制成單細(xì)胞懸液，再分別加入Annexin VFITC和PI染色液各5 μL，輕柔混勻，室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC939細(xì)胞，經(jīng)對(duì)照組培養(yǎng)基、隱丹參酮 20 μmol/L、吉西他濱2 μg/mL及隱丹參酮10 μmol/L+ 吉西他濱1 μg/mL處理48 h后，RIPA裂解液各組細(xì)胞，提取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔蛋白上樣量為20 μg，8% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后以250 mA恒流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax、JNK、STAT3、p-STAT3（Ser727）抗體為一抗，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5 000），37 ℃孵育1 h；ECL顯色，電化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮及吉西他濱對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞增殖的抑制作用 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，0、10、20、30、40、50 μmol/L隱丹參酮分別作用24、48 h，均能明顯抑制膽管癌QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，隱丹參酮對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞增殖的抑制率增加。同法，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/mL 吉西他濱分別作用24、48 h，膽管癌QBC939細(xì)胞增殖存在抑制作用，見(jiàn)圖1。

2.2 隱丹參酮及吉西他濱對(duì)QBC939細(xì)胞凋亡的影 響 與對(duì)照組比較，隱丹參酮、吉西他濱作用24 h對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。在QBC939細(xì)胞中，隱丹參酮組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率分別為（19.80±0.92）%、 （24.20±0.56）%和（35.40±1.57）%，均明顯高于對(duì)照組的（8.84±0.58）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組高于隱丹參酮組及吉西他濱組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度隱丹參酮、吉西他濱對(duì)膽管癌QBC939的生長(zhǎng)抑制率

圖2 隱丹參酮、吉西他濱及兩者聯(lián)合用藥對(duì)QBC939細(xì)胞凋亡的影響

2.3 隱丹參酮、吉西他濱及兩者聯(lián)合用藥對(duì)QBC939細(xì)胞中Caspase凋亡通路及JAK2/STAT3通路的影響 對(duì)照組、隱丹參酮組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組作用48 h后，Western blot檢測(cè)膽管癌細(xì)胞中蛋白Active Caspase-3、Bcl-2及Bax的表達(dá)，結(jié)果顯示隱丹參酮單獨(dú)用藥、吉西他濱單獨(dú)用藥或兩者聯(lián)合用藥后，膽管癌QBC939細(xì)胞中的Bcl-2的表達(dá)下降，Active Caspase-3及Bax的表達(dá)均升高，表明此時(shí)細(xì)胞中Caspase凋亡通路已被激活；經(jīng)隱丹參酮單獨(dú)用藥、吉西他濱單獨(dú)用藥或兩者聯(lián)合用藥后，膽管癌QBC939細(xì)胞中的p-JAK2及p-STAT3（Ser727）蛋白表達(dá)水平下降，聯(lián)合用藥與隱丹參酮單獨(dú)用藥相比Bcl-2、p-JAK2及p-STAT3（Ser727）水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Active Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合用藥與吉西他濱單獨(dú)用藥相比Bcl-2、p-JAK2及p-STAT3（Ser727）表達(dá)水平下降，Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

膽管癌是第二常見(jiàn)的肝癌類型，是由膽道系統(tǒng)上皮細(xì)胞引起的惡性腫瘤，是治療最困難的腹腔內(nèi)癌癥之一，具有高度的侵襲性，不可切除或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的膽管癌預(yù)后極差。OKUSAKA等[10]研究表明單藥吉西他濱治療療效有限并具有一定毒性，尋找一種增加吉西他濱的療效且降低其不良反應(yīng)的藥物具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移等均有明顯抑制作用。

圖3 Western blot檢測(cè)隱丹參酮、吉西他濱及兩者聯(lián)合用藥作用48 h后對(duì)QBC939細(xì)胞中Active Caspase-3、Bcl-2、Bax、JAK2及STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)情況

隱丹參酮作為丹參的主要活性成分之一，有研究表明隱丹參酮具有顯著的抗腫瘤作用[4-5，11-12]。隱丹參酮可通過(guò)激活Caspase凋亡通路誘導(dǎo)卵巢癌A2780細(xì)胞的凋亡，并抑制卵巢癌A2780細(xì)胞的遷移和侵襲[13-14]。本研究中通過(guò)隱丹參酮（0、10、20、30、40和50 μmol/L）處理QBC939細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隱丹參酮能夠明顯抑制QBC939細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究利用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱丹參酮 （10 μmol/L）聯(lián)合吉西他濱（1 μg/mL）對(duì)QBC939細(xì)胞的抑制作用均大于隱丹參酮（20 μmol/L）和吉西他濱（2 μg/mL）單用，存在較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。

我們發(fā)現(xiàn)隱丹參酮能抑制膽管癌QBC939細(xì)胞的JAK2及STAT3的磷酸化。研究表明隱丹參酮可抑制舌鱗癌CAL27細(xì)胞的STAT3的磷酸化，舌鱗癌CAL27中STAT3磷酸化的抑制導(dǎo)致STAT3下游靶蛋白 （survivin、cyclin d1和Bcl xL）的表達(dá)下調(diào)[9]。類 似的研究表明隱丹參酮可通過(guò)阻止STAT3信號(hào)通路的激活，抑制結(jié)腸癌和腎癌的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡，表明隱丹參酮是一種有效的STAT3抑制劑[15-16]。 吉西他濱也存在抑制STAT3磷酸化的作用[17-18]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隱丹參酮單藥或協(xié)同吉西他濱能夠顯著抑制p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)，進(jìn)而減少抗凋亡蛋白Bcl-2和上調(diào)凋亡蛋白Active Caspase-3。由此推測(cè)，STAT3信號(hào)通路的抑制可能與隱丹參酮增強(qiáng)吉西他濱在膽管癌QBC939細(xì)胞抗腫瘤作用有關(guān)。

綜上，本研究表明隱丹參酮具有潛在的臨床治療膽管癌的價(jià)值，聯(lián)合吉西他濱具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能與STAT3信號(hào)通路相關(guān)。