吳釗航，董偉杰，薛鵬鵬，左佳怡，王麗芬，袁健東，徐荷林

（1.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 骨外科，浙江 溫州 325015）

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中常見的疾病之一，易于轉(zhuǎn)移并且難以治療，表現(xiàn)出較高的復(fù)發(fā)率和病死率，對神經(jīng)系統(tǒng)的功能具有很大的危害[1]。腦膠質(zhì)瘤的治療至今沿用傳統(tǒng)的外科手術(shù)+藥物治療+經(jīng)顱放療綜合治療模式。但由于腦膠質(zhì)瘤具有侵襲和轉(zhuǎn)移的特點，手術(shù)時腫瘤邊界難以精確定位導(dǎo)致手術(shù)切除不徹底，致使微小病灶殘留[2]。術(shù)后微小病灶的殘留是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后不良的重要原因。因此準確識別原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤邊界和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞不僅是完全切除的主要因素，還是預(yù)防神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[3]。

術(shù)中MRI成像、近紅外熒光成像以及多種方式相結(jié)合的多模態(tài)成像可使原發(fā)性腫瘤病灶可視化，精準定位轉(zhuǎn)移性微小腫瘤結(jié)節(jié)，引導(dǎo)腫瘤精準切 除[4-5]。無論是發(fā)光腫瘤模型還是手術(shù)前造影劑標記腫瘤模型，均證明成像引導(dǎo)的手術(shù)切除相比自然光下的標準手術(shù)在提高腫瘤切除完全率，降低腫瘤復(fù)發(fā)率以及提高患者術(shù)后存活率等方面具有明顯的優(yōu)勢，近年來受到廣泛關(guān)注。DOGLIETTO等[6]結(jié)合熒光物質(zhì)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和高清晰度的三維立體鏡，用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)切除。盡管許多研究已經(jīng)使用諸如5-ALA和熒光素鈉之類的熒光物質(zhì)來指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的切除，但是仍然存在一些問題如熒光穩(wěn)定性差和熒光效率低等[7]。

量子點（quantum dots，QDs）具有良好的熒光信號和穩(wěn)定性，較寬的激發(fā)光譜和較窄的發(fā)射光譜，并已應(yīng)用于標記特異性細胞和組織以實現(xiàn)多色生物成像[8-10]。但QDs由于其理化特性容易受到環(huán)境影響從而導(dǎo)致細胞毒性，這使得其應(yīng)用受到限制[11]。研究發(fā)現(xiàn)將QDs與脂質(zhì)體相結(jié)合，不僅改善了QDs的穩(wěn)定性，使其能保持熒光，還大大降低了其生物毒性[12]，而且還可以對載體進行修飾，使其能夠靶向作用在腫瘤區(qū)域，提高其成像精確度。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞表達αvβ3整合素，可以與含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列短肽特異性結(jié)合[13]。相比之 下，RGDyk環(huán)肽對αvβ3整合素具有更強的親和力和更高的特異性，已被眾多研究用作靶向配基來修飾納米藥物載體[14-15]。本研究擬以靶向腦膠質(zhì)瘤的RGDyk環(huán)肽修飾脂質(zhì)體包載QDs，用于腦膠質(zhì)瘤的精準成像，實現(xiàn)術(shù)中熒光成像引導(dǎo)的腫瘤精準切除。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 氫化大豆磷脂（HSPC）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基（DSPE-PEG-NH2）、膽固醇購自上海艾維特公司；c(RGDyk)環(huán)肽購自上海吉爾生化多肽公司；ZnCdSe/ZnS量子點購自武漢伽源量子點公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自上海阿拉丁公司；2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）購自日本株式會社同仁化學研究所；PC12和C6細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體制備：稱取85 mg HSPC，5 mg DSPE-PEG-NH2和10 mg膽固醇至25 mL圓底燒瓶中，加入10 mL乙醚，600 r/min 攪拌使溶解后，至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃蒸除乙醚，形成均勻的脂質(zhì)膜后，將一定量的QDs添加到適量磷酸鹽緩沖液（PBS pH 7.4）加入上述脂質(zhì)膜中，旋轉(zhuǎn)洗膜，用超聲波發(fā)生器在300 W超聲30 min后，即可得到多室脂質(zhì)體混懸液，分別依次過400 nm和100 nm碳酸酯膜擠出整粒，得到平均粒徑100 nm以下的小單室脂質(zhì)體。c(RGDyk)環(huán)肽溶液在室溫下經(jīng)EDC/NHS活化后，加入至上述單室脂質(zhì)體混懸液中，輕輕攪拌反應(yīng)4 h，超濾除去縮合劑以及未反應(yīng)的c(RGDyk)環(huán)肽，即可得到c(RGDyk)環(huán)肽修飾的量子點脂質(zhì)體[QDs-c(RGDyk)-Lip]。

1.2.2 粒徑以及形態(tài)：動態(tài)光散射激光粒度測定儀（LitesizerTM 500，奧地利安東帕公司）對游離的QDs以及c(RGDyk)環(huán)肽修飾的量子點脂質(zhì)體進行粒徑和Zeta電位的測定。樣品經(jīng)過適當稀釋后，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm，散射角為90°測定其粒徑以及Zeta電位。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測游離的QDs以及c(RGDyk)環(huán)肽修飾的量子點脂質(zhì)體形態(tài)。取樣品滴于鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，以無纖維濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，以200 kV加速電壓，TEM（JEM1200EX，日本JEOL公司）檢視并拍照。

1.2.3 熒光光譜：熒光分光光度計（RF-6000，日本Shimadzu公司）對游離的QDs以及c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體進行熒光發(fā)射光譜分析。激發(fā)波長設(shè)置為450 nm，在500～800 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)進行掃描，掃描間隔為1.0 nm，掃描速度為2 000 nm/min。 QDs-c(RGDyk)-Lip與含有10% FBS的pH 7.4 PBS在37 ℃孵育不同時間后，固定激發(fā)波長為450 nm，檢測發(fā)射波長610 nm處的熒光強度變化，檢測其在生理相關(guān)介質(zhì)中的熒光穩(wěn)定性。

1.2.4 細胞毒性：體外CCK-8法評估QDs-c(RGDyk)-Lip對正常PC12神經(jīng)細胞以及C6腫瘤細胞的毒性。C6細胞在含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、 鏈霉素（100 μg/mL）以及谷氨酰胺（2 mmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；PC12細胞則利用DMEM高葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)；細胞放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期時進行實驗操作。將PC12細胞或C6細胞接種到裝有100 μL培養(yǎng)基的96孔板（每孔3×103）中培養(yǎng)過夜。然后，加入含有QDs-c(RGDyk)-Lip的培養(yǎng)基，進一步培養(yǎng)24 h或48 h，PBS洗滌2次，加入10 μL CCK-8，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處測量吸光度。按照如下公式計算細胞的存活率（%）。細胞存活率（%）=[（A加藥－A空白）÷（A0加藥－ A空白）]×100%。A加藥：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A0加藥：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.5 腫瘤細胞靶向性：C6細胞以每孔1×106個細胞的密度接種在6孔板的蓋玻片上，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。加入含有游離QDs（30 nmol/L）或 QDs-c(RGDyk)-Lip（相對應(yīng)QDs濃度為30 nmol/L）的培養(yǎng)基，孵育2 h，冷PBS沖洗，DAPI（1 mg/mL）染色，熒光顯微鏡（尼康，日本）觀察。為了證明QDs-c(RGDyk)-Lip的c(RGDyk)靶向性，貼壁C6細胞預(yù)先用游離的c(RGDyk)孵育2 h，后加入含有QDsc(RGDyk)-Lip（相對應(yīng)QDs濃度為30 nmol/L）的培養(yǎng)基孵育2 h，觀察細胞熒光強度變化。

1.2.6 體內(nèi)靶向性：按照文獻方法[16]建立C6腦膠質(zhì)瘤大鼠模型。荷瘤大鼠6只分為2組，每組3只，分別尾靜脈注射游離QDs溶液（50 nmol/L）和QDsc(RGDyk)-Lip（相當于QDs濃度為50 nmol/L）。2 h 后，將荷瘤大鼠處死，0.9%氯化鈉溶液心臟灌流后，分離出荷瘤大腦，放置在活體成像儀內(nèi)進行離體熒光成像。同時，荷瘤大腦進行冰凍切片，DAPI染色 后，置熒光顯微鏡下觀察組織熒光分布。

1.2.7 熒光引導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤精準切除：荷瘤大鼠6只分為2組，每組3只，分為熒光引導(dǎo)手術(shù)組和白光手術(shù)組。熒光引導(dǎo)手術(shù)組靜脈注射QDs-c(RGDyk)-Lip（相當于QDs濃度為50 nmol/L）2 h后，麻醉大鼠，乙醇皮膚消毒，在腫瘤上方行一個約1.5 cm的切口，在暗室激光照射腦組織造成熒光手術(shù)環(huán)境，在顯微鏡下用顯微鏡的鑷子和剪刀手術(shù)切除。白光手術(shù)組荷瘤大鼠直接在白光下開顱，實行腫瘤切除。為了評估手術(shù)邊緣是否存在殘留的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病變組織，從手術(shù)邊緣提取厚度為3 mm的活檢樣本，并用4%多聚甲醛固定以進行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體的制備與表征 ZnCdSe/ZnS的QDs具有較高的毒性，本實驗以氫化大豆磷脂，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基和膽固醇為材料，采用逆向蒸發(fā)法制備包載QDs的脂質(zhì)體。后經(jīng)EDC/NHS介導(dǎo)的縮合反應(yīng)，將RGDyk環(huán)肽與QDs-Lip表面氨基鍵合，制備c(RGDyk)環(huán)肽修飾的量子點脂質(zhì)體（QDs-c(RGDyk)-Lip）。動態(tài)光散射（dynamic light scatting，DLS）以及TEM技術(shù)對QDs-(RGDyk)-Lip進行了粒徑與形態(tài)表征，結(jié)果如圖1所示。DLS結(jié)果顯示，游離QDs的粒徑約為35 nm，而QDs-(RGDyk)-Lip粒徑增大為175 nm，且分布較為集中（PDI=0.12）。TEM結(jié)果顯示，游離QDs呈稀疏的點狀分布，其大小同DLS結(jié)果相近；而QDs-(RGDyk)-Lip則呈囊泡狀，且其中心可見數(shù)個微小QDs聚集，表明QDs有效包裹在脂質(zhì)體內(nèi)。

圖1 游離量子點（A、C）和QDs-(RGDyk)-Lip（B、D）粒徑分布與TEM形態(tài)

2.2 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體的穩(wěn)定性 RGDyk環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體在白光下，呈淺粉紅色渾濁液，而在405 nm紫外光照射下，則發(fā)射出強的紫紅色熒光，見圖2A。對其發(fā)射熒光進行光譜掃描（見圖2B），游離QDs和QDs-(RGDyk)-Lip均顯示出在610 nm處的最大發(fā)射波長，而且由于包裹后聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)射效應(yīng)，QDs-(RGDyk)-Lip熒光強度較游離QDs略增強。這些特性表明QDs包載在脂質(zhì)體后，其熒光發(fā)射特性不受損害。為了考察QDs-(RGDyk)-Lip在生理相關(guān)介質(zhì)中的穩(wěn)定性，QDs-(RGDyk)-Lip與含有10% FBS的pH 7.4 PBS于37 ℃孵育不同時間后，檢測其在610 nm處熒光強度以及粒徑變化（見圖2C-D），游離QDs在孵育過程中，其熒光強度逐漸降低，48 h孵育后降低20%，而QDs-(RGDyk)-Lip則在整個檢測時間內(nèi)熒光強度沒有發(fā)生明顯改變，48 h 孵育后，熒光強度僅僅5%降低，這表明脂質(zhì)體包裹能提高量子點熒光穩(wěn)定性，同時，QDs-(RGDyk)-Lip整個孵育過程中未見明顯的粒徑及粒徑分布指數(shù)（particle distribution index，PDI）改變，進一步說明QDs-(RGDyk)-Lip在生理相關(guān)介質(zhì)中的穩(wěn)定性。

2.3 細胞毒性實驗 QDs-c(RGDyk)-Lip對正常PC12細胞以及C6腫瘤細胞株均展現(xiàn)出劑量依賴性的微弱細胞毒性，而且C6膠質(zhì)瘤細胞相比PC12細胞具有更高的敏感性，見圖3。孵育24 h后，QDs-c(RGDyk)-Lip在5～60 μg/mL濃度范圍內(nèi)對PC12幾乎無細胞毒性，在濃度80～100 μg/mL展現(xiàn)出略微微弱的毒性。而QDs-c(RGDyk)-Lip對C6細胞，在濃度為40 μg/mL 時能觀察到對細胞的損傷，當濃度為100 μg/mL時，細胞的存活率約為82%。孵育48 h后，QDs-c(RGDyk)-Lip對2種細胞株展現(xiàn)出相似的趨勢，但與24 h結(jié)果相比，沒有顯著增大。相比PC12細胞，QDs-c(RGDyk)-Lip對C6膠質(zhì)瘤細胞具有更高的細胞毒性可能是因為C6細胞表面更高的αvβ3整合素受體表達，促進更多的QDs攝取進入細胞。

2.4 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體體對膠質(zhì)瘤細胞的靶向性成像 C6細胞與QDs或QDs-(RGDyk)-Lip孵育2 h后，激光共聚焦顯微鏡對細胞進行顯像，見圖4。游離QDs處理細胞僅在細胞外緣顯示出微弱的紅色熒光，而QDs-c(RGDyk)-Lip處理的細胞周圍顯示出強的紅色熒光，而且能清晰顯示其細胞質(zhì)骨架，表明QDs-c(RGDyk)-Lip對C6細胞特異靶向性。C6細胞表面整合素受體預(yù)先用游離c(RGDyk)飽和后，評價其對QDs-c(RGDyk)-Lip攝取變化，結(jié)果顯示，與QDs-c(RGDyk)-Lip相比，游離c(RGDyk)+QDs-(RGDyk)-Lip處理組細胞熒光明顯降低，僅在細胞外緣表面顯示微弱紅色熒光，表明QDs-(RGDyk)-Lip的靶向性與C6膠質(zhì)瘤細胞膜表面的整合素有關(guān)。

圖2 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的量子點脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

圖3 QDs-(RGDyk)-Lip對C6和PC12的細胞毒性

2.5 c(RGDyk)環(huán)肽修飾的QDs脂質(zhì)體體內(nèi)腫瘤靶向性 離體熒光成像結(jié)果顯示，游離QDs組大鼠的腦組織觀察到微弱的紅色背景信號，但腫瘤組織區(qū)域（黃色虛線標注）熒光信號并未強于背景熒光，表明游離的QDs無法向膠質(zhì)瘤組織聚集。相比之下，QDsc(RGDyk)-Lip組大鼠腦組織腫瘤區(qū)域則顯示出強的熒光信號，明顯高于周邊正常組織產(chǎn)生的背景熒光，表明QDs-c(RGDyk)-Lip靜脈注射后特異分布在腦膠質(zhì)瘤組織，展現(xiàn)出體內(nèi)特異腫瘤靶向性。離體荷瘤大腦進一步進行冰凍切片，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，游離QDs組腦組織無論在腫瘤區(qū)域（T）還是腦實質(zhì)區(qū)域（P）均無QDs有關(guān)的紅色熒光信號，與離體成像結(jié)果一致。相比之下，QDs-(RGDyk)-Lip組大腦組織僅僅在腫瘤區(qū)域（T）內(nèi)展示出強的QDs有關(guān)的紅色熒光，在腦實質(zhì)區(qū)域（P）未見有熒光，表明QDs-(RGDyk)-Lip能精確定位在膠質(zhì)瘤區(qū)域。見圖5。

2.6 熒光成像引導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤精準切除 術(shù)中腫瘤區(qū)域顯像如圖6所示，在手術(shù)切除前的明視野圖像中，熒光引導(dǎo)手術(shù)組和白光手術(shù)組均可觀察到明顯的神經(jīng)膠質(zhì)瘤區(qū)，但在白光下只能觀察到模糊的腫瘤區(qū)域，而在熒光下可以觀察到腫瘤與腦實質(zhì)間清晰的邊界。白光手術(shù)組的神經(jīng)膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤實行經(jīng)驗式切除，熒光引導(dǎo)手術(shù)組的神經(jīng)膠質(zhì)瘤大鼠進行熒光引導(dǎo)腫瘤切除，直到在腫瘤區(qū)未觀察到熒光信號為止。手術(shù)切除后，取切口邊緣 3 mm厚的組織進行切片，HE染色，評價手術(shù)切除的效果。結(jié)果顯示，白光手術(shù)組切除的活檢樣本在正常的腦實質(zhì)（P）邊緣觀察到了殘留的神經(jīng)膠質(zhì)瘤（T），能觀察到明顯的殘留腫瘤組織，而熒光引導(dǎo)手術(shù)組的活檢樣本在切口邊緣（黃色虛線所示）未見有殘留的腫瘤組織，表明QDs-c(RGDyk)-Lip對腦膠質(zhì)瘤熒光成像能引導(dǎo)術(shù)中腫瘤精準切除。

3 結(jié)論

由于顱內(nèi)腫瘤的過度生長及其邊界模糊，手術(shù)難以完全切除是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的重要原因。準確定位腫瘤邊界實行精準切除是目前腦膠質(zhì)瘤手術(shù)治療成功與否的關(guān)鍵。有許多成像技術(shù)可以幫助最大程度地切除腫瘤。如手術(shù)前經(jīng)顱磁刺激和彌散張量成像檢查，以及手術(shù)中的超聲導(dǎo)航和直接皮層刺激導(dǎo)航等都能定位腫瘤邊界，引導(dǎo)手術(shù)切除[17]。但由于這些技術(shù)的成本高、可操作性差以及檢測靈敏性低等局限，尚未在臨床上廣泛使用。熒光成像引導(dǎo)的手術(shù)切除在提高腫瘤切除完全率，降低腫瘤復(fù)發(fā)以及提高患者術(shù)后存活率等方面具有明顯的優(yōu)勢，近年來受到臨床外科醫(yī)師廣泛關(guān)注[18]。本研究構(gòu)建了c(RGDyk)環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體包載QDs，并對其粒徑、形態(tài)以及熒光發(fā)射性質(zhì)進行了表征，評價了其體內(nèi)外對腦膠質(zhì)瘤的成像可行性以及術(shù)中熒光成像引導(dǎo)腫瘤切除的精準性。結(jié)果表明，QDsc(RGDyk)-Lip粒徑大小為175 nm，在生理相關(guān)介質(zhì)中具有良好的粒徑與熒光穩(wěn)定性；QDs-(RGDyk)-Lip體外不但對PC12腦神經(jīng)細胞具有低毒性，而且可以有效地靶向C6腫瘤使其熒光顯像。動物實驗表明QDs-c(RGDyk)-Lip靜脈注射后能高效地靶向原位荷瘤大鼠腦膠質(zhì)瘤，使其發(fā)射強熒光引導(dǎo)手術(shù)精準切除。

圖6 荷瘤大鼠靜脈注射QDs-(RGDyk)-Lip后實行熒光成像手術(shù)及術(shù)后切口邊緣HE染色（×200）