馮靜，周冰謙，劉謙，王曉，盧恒，郭蘭萍，劉偉*，史國玉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京100700；4.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 濟(jì)南 250002)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰的功效[2]。丹參為多年生草本植物，野生資源無法滿足市場(chǎng)的需求，主要來源為人工栽培。目前丹參栽培一年即采收，而連年的復(fù)種導(dǎo)致丹參土壤環(huán)境發(fā)生改變，植物無法適應(yīng)環(huán)境的改變而產(chǎn)生致害作用，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)連年下降，連作障礙成為丹參栽培過程中最為突出的問題，危及丹參臨床用藥的安全性、有效性、穩(wěn)定性和可控性[3-5]。

連作障礙的形成是植物-土壤系統(tǒng)中多種因素綜合作用的結(jié)果，主要包括土壤環(huán)境及其理化性質(zhì)的改變、土壤微生物種群的改變以及化感自毒作用[6-9]。研究表明，酚酸類化感自毒物質(zhì)是引起連作障礙的重要因素之一[10-11]，而植物根系分泌的酚酸類自毒物質(zhì)能夠顯著影響土壤微生物的生物量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)[12]。丹參連作不僅使土壤酸化，并且對(duì)其根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性影響較大，造成土壤中優(yōu)勢(shì)菌群如水恒桿菌屬及伯克霍爾德氏菌的比例下降以及變形菌門、纖維弧菌屬豐度降低[13]。丹參連作一年，土壤中赤霉菌屬、馬鞍菌屬和梨孢菌屬豐度顯著增加，酵母菌屬豐度降低；連作兩年，土壤中鐮刀霉菌、赤霉菌屬、毛殼菌屬和馬鞍菌屬的豐度顯著增加，并且新增了Knufia、Clydaea與立枯絲核菌[3,14]。須根處理后的丹參土壤酸性組分較空白組增加了19.30倍，且新增了鄰苯二甲酸等化感物質(zhì)[3]。百合、花生、含喜樹堿植物、野菊的根系分泌物中含有鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，且鄰苯二甲酸對(duì)花生的發(fā)芽和根系生長(zhǎng)具有抑制作用[15-18]。然而，有關(guān)丹參植株分泌的酚酸類自毒物質(zhì)與病原菌生長(zhǎng)之間的相互作用研究尚未見報(bào)道。

本研究選取鄰苯二甲酸與立枯絲核菌為實(shí)驗(yàn)材料，研究丹參連作障礙產(chǎn)生的酚酸類自毒物質(zhì)與病原菌之間的相互作用，以期揭示二者與丹參連作障礙的內(nèi)在聯(lián)系，為研究丹參連作障礙提供新的思路和方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

丹參采自萊蕪紫光生態(tài)園有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.；立枯絲核菌購于廣東省微生物菌種保藏中心；鄰苯二甲酸，分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基，均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

BAS124S分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Agilent 7890A氣相色譜儀(安捷倫有限公司)；Agilent-1120高效液相色譜儀(安捷倫有限公司)；SW-CJ-2FD單面垂直凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TGL-16醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 丹參植株內(nèi)鄰苯二甲酸酯類化合物提取與分離

2.1.1 樣品溶液的制備

將丹參地上部與地下部分別粉碎，過篩，精密稱取樣品粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲提取30 min，取上清液過0.22 μm濾膜，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯6種標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g置于10 mL容量瓶中，加入甲醇充分溶解，并定容至10 mL，混勻，備用。

取上述6種標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，過0.22 μm濾膜備用。

2.1.3 GC分析條件

氣相色譜柱：HP-5(30 m×250 μm，0.5 μm)；流速1 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫：程序升溫，60 ℃(保持2 min)，以5 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；接口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

2.2 鄰苯二甲酸濃度實(shí)驗(yàn)

稱取PDA培養(yǎng)基置于錐形瓶中，加入蒸餾水，混勻，封口，115 ℃高壓滅菌20 min備用。配制0.1 g/mL的鄰苯二甲酸母液備用。分別在未凝固的PDA培養(yǎng)基中精密加入相應(yīng)濃度的鄰苯二甲酸乙醇溶液，不同濃度鄰苯二甲酸處理分為CK(空白對(duì)照)，A，B，C，D共5組(表1)。取一定量立枯絲核菌菌絲加入無菌水中重懸，備用。精密移取100 μL菌液于培養(yǎng)皿中涂板，涂布均勻后倒置，于25 ℃連續(xù)培養(yǎng)6 d，每隔24 h觀察其生長(zhǎng)狀況，6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖1所示，對(duì)PDA培養(yǎng)基上的立枯絲核菌的菌落數(shù)和菌落最大直徑進(jìn)行計(jì)算和測(cè)量。

表1 不同濃度鄰苯二甲酸處理Table 1 Groups with different concentrations of phthalic acid

圖1 培養(yǎng)6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth status of Rhizoctonia solani under different treatment groups of phthalic acid on PDA medium after 6 days

稱取PDB培養(yǎng)基置于燒杯中，加入蒸餾水，混勻，分裝至錐形瓶中，封口，121 ℃高壓滅菌20 min備用。配制0.1 g/mL的鄰苯二甲酸母液備用。取一定量立枯絲核菌菌絲加入無菌水中重懸，備用。按照表1不同處理組別處理，將其中PDA培養(yǎng)基替換成PDB培養(yǎng)基，25 ℃下在搖床中(120 r/min)恒溫黑暗培養(yǎng)立枯絲核菌6 d，每隔24 h觀察其生長(zhǎng)狀況。

2.3 立枯絲核菌代謝物提取與分析

2.3.1 立枯絲核菌代謝物提取

培養(yǎng)6 d后，取1 mL PDB培養(yǎng)基置于EP管中，加入400 μL色譜純甲醇沉淀蛋白，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，放入離心機(jī)，15 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，進(jìn)樣HPLC進(jìn)行分析。

2.3.2 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Water-Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：40 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：A相為0.3%甲酸水溶液，B相為甲醇，程序梯度洗脫，見表2。

表2 高效液相色譜儀程序梯度洗脫Table 2 Gradient elution by HPLC

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鄰苯二甲酸對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將鄰苯二甲酸對(duì)照品溶液按照2.3.2項(xiàng)下的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，以鄰苯二甲酸峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)對(duì)鄰苯二甲酸進(jìn)行線性回歸擬合，得到回歸方程為Y=454 858X-107.14，r2=0.998 1，鄰苯二甲酸在0.001～0.015 mg范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.3.5 樣品中鄰苯二甲酸含量測(cè)定

將供試品溶液按照2.3.2項(xiàng)下的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積代入回歸方程中計(jì)算鄰苯二甲酸的含量(表3)。

表3 供試品溶液中鄰苯二甲酸含量(n=3)Table 3 Phthalic acid content in sample solution(n=3) 單位：mg/mL

3 結(jié)果

3.1 丹參樣品中鄰苯二甲酸酯類成分分析

將丹參樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行保留時(shí)間的比較，丹參地上部樣品中含有鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯6種鄰苯二甲酸酯類成分(圖2)，總相對(duì)含量為8.264%；丹參地下部樣品中含有鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯5種鄰苯二甲酸酯類成分(圖3)，總相對(duì)含量為1.069%。

時(shí)間/min1—鄰苯二甲酸二甲酯；2—鄰苯二甲酸二異丁酯；3—鄰苯二甲酸二丁酯；4—鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯；5—鄰苯二甲酸二環(huán)己酯；6—鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯。圖2 丹參地上部中鄰苯二甲酸酯類化學(xué)成分Fig. 2 PAEs in the aboveground portion of Salvia miltiorrhiza Bge.

時(shí)間/min1—鄰苯二甲酸二異丁酯；2—鄰苯二甲酸二丁酯；3—鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯；4—鄰苯二甲酸二環(huán)己酯；5—鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯。圖3 丹參地下部中鄰苯二甲酸酯類化學(xué)成分Fig. 3 PAEs in the underground portion of Salvia miltiorrhiza Bge.

3.2 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)立枯絲核菌

培養(yǎng)6 d后，CK組與A組作為對(duì)照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間后對(duì)照組未有菌體生成；C組較B組菌落數(shù)增加了25.33%，較D組菌落數(shù)增加了54.26%，B組較D組菌落數(shù)增加了23.08%；當(dāng)PDA培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時(shí)，立枯絲核菌菌落數(shù)最多，當(dāng)PDA培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時(shí)，立枯絲核菌菌落數(shù)最少(圖4)。

圖4 不同處理組PDA培養(yǎng)基上立枯絲核菌菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 Colony count of Rhizoctonia solani in PDA medium of different treatment groups

培養(yǎng)6 d后，加入不同濃度鄰苯二甲酸的PDA培養(yǎng)基中立枯絲核菌菌落最大直徑存在顯著性差異(P<0.05)，見圖5。其中CK組與A組作為對(duì)照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間后對(duì)照組未有菌體生成；當(dāng)PDA培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時(shí)立枯絲核菌菌落最大直徑平均值最大，為5.21 mm；當(dāng)PDA培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時(shí)立枯絲核菌菌落最大直徑平均值最小，為1.84 mm；當(dāng)PDA培養(yǎng)基中未加入鄰苯二甲酸(B組)時(shí)菌落最大直徑平均值為4.07 mm。

圖5 不同處理組PDA培養(yǎng)基上立枯絲核菌菌落最大直徑均值Fig.5 The average of maximum diameter of the colony count of Rhizoctonia solani in PDA medium of different treatment groups

3.3 PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)立枯絲核菌

培養(yǎng)6 d后，立枯絲核菌生長(zhǎng)狀況見圖6。其中CK組與A組作為對(duì)照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間后對(duì)照組未有菌體生成。當(dāng)PDB培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時(shí)立枯絲核菌菌落最多，其質(zhì)量為17.78 g；PDB培養(yǎng)基中未加入鄰苯二甲酸(B組)時(shí)，菌落數(shù)次之，其質(zhì)量為14.45 g；當(dāng)PDB培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時(shí)立枯絲核菌菌落最少，其質(zhì)量為5.41 g(圖7)。

圖6 培養(yǎng)6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Fig. 6 The growth status of Rhizoctonia solani in different treatment groups of phthalic acid in PDB medium after 6 days

圖7 培養(yǎng)6 d后不同處理組中立枯絲核菌質(zhì)量Fig.7 The weight of Rhizoctonia solani in different treatment groups of phthalic acid in PDB medium after 6 days

3.4 PDB培養(yǎng)基中立枯絲核菌代謝物分析

不同處理組別PDB培養(yǎng)基中立枯絲核菌代謝物分離色譜圖見圖8。將樣品色譜圖與鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行保留時(shí)間的比較，A組、C組、D組中均檢測(cè)出鄰苯二甲酸，但通過含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與初始加入量相比，3組鄰苯二甲酸含量幾乎無變化。

時(shí)間/min1—對(duì)照品；2—PDB培養(yǎng)基供試品。圖8 對(duì)照品、PDB培養(yǎng)基供試品的HPLCFig. 8 HPLC of reference and PDB medium sample

4 討論

丹參作為常用大宗藥材之一，每年的需求量高達(dá)2萬噸[3]，野生資源無法滿足市場(chǎng)的需求量，因此丹參藥材的主要來源為人工栽培，而連年的復(fù)種造成丹參土壤環(huán)境發(fā)生改變，丹參產(chǎn)量和品質(zhì)下降[19-20]，連作障礙成為丹參生產(chǎn)過程中亟待解決的問題。

連作丹參土壤中鄰苯二甲酸含量相對(duì)較高[3]，立枯絲核菌豐度增加[13]。立枯絲核菌是造成水稻紋枯病、馬鈴薯莖基腐病的主要病原菌，也是造成植物立枯病的主要真菌[21]。立枯病作為一種土傳病害，是造成連作障礙的重要原因之一[22]。

目前對(duì)于丹參連作障礙的研究?jī)H限于土壤病原菌或酚酸類自毒物質(zhì)[13-14]，對(duì)于二者之間的研究并未有報(bào)道。本研究中將導(dǎo)致丹參連作障礙發(fā)生的酚酸類自毒物質(zhì)鄰苯二甲酸與病原真菌立枯絲核菌進(jìn)行互作研究，通過室內(nèi)菌絲生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸對(duì)立枯絲核菌的生長(zhǎng)具有濃度效應(yīng)，這與田給林[23]研究的酚酸對(duì)草莓尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)效應(yīng)結(jié)果一致。在相同培養(yǎng)條件下，鄰苯二甲酸的加入促進(jìn)了立枯絲核菌的生長(zhǎng)繁殖，但其含量在菌絲生長(zhǎng)前后無變化。由此推測(cè)鄰苯二甲酸會(huì)起到類似于催化劑的作用，使立枯絲核菌快速生長(zhǎng)并致害丹參，與大田中丹參連作障礙在8月份爆發(fā)的現(xiàn)象相符合。通過對(duì)鄰苯二甲酸與立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)互作研究，旨在從酚酸類化感自毒物質(zhì)與病原菌方面揭示丹參連作障礙產(chǎn)生的原因，為解決丹參連作障礙提供理論依據(jù)。