劉京華，譚旺曉，王斯維，王雨，王小瑩

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

2019年暴發(fā)的新冠肺炎(COVID-19)，具有顯著的傳染性，目前已成為全球性問題[1-2]。在COVID-19治療早期以中醫(yī)藥干預(yù)為主，通過中西醫(yī)結(jié)合的治療方針，能夠充分發(fā)揮中醫(yī)藥在疫情防治中的作用[3]。

中醫(yī)理論辯證COVID-19的發(fā)病機(jī)制為濕邪致病，初期表型為寒濕，中期以濕阻肺脾證和濕熱蘊(yùn)肺證最為常見，后期多表現(xiàn)為氣陰兩虛證和肺脾氣虛證[4]。由COVID-19診療方案的中醫(yī)分期病機(jī)特點(diǎn)可知，在使用頻次超過兩次的17味中藥中，葶藶子居于止咳平喘藥的首位[5]，發(fā)揮藥效的主要成分為葶藶子中的芥子苷與β-谷甾醇。研究報(bào)道，β-谷甾醇具有舒張支氣管平滑肌及祛痰作用[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葶藶子具有較強(qiáng)的利尿作用，與杏仁、大黃配伍可用于治療胸脅積水[7]；還具有廣譜抗菌作用[8]，可通過抗炎與抗氧化作用來保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷，從而起到保護(hù)心臟作用[9]。COVID-19疫情發(fā)生以來，復(fù)方藥在抗疫方面起到重要的作用，曹新福等[10]報(bào)道葶藶子與石膏配伍在防治COVID-19用藥中的置信度最高，而葶藶大棗瀉肺湯是由葶藶子和大棗組成的中藥復(fù)方。北宋《開寶本草》述該藥“療肺壅上氣咳嗽，止喘促，除胸中痰飲”[8]。清代名醫(yī)張璐在《千金方衍義》中指出“葶藶破水瀉肺，大棗護(hù)脾通津，乃瀉肺而不傷脾之法，保全母氣以為向后復(fù)長(zhǎng)肺葉之根本”[11]。葶藶子具有入肺瀉氣和開結(jié)利水之功效，可使肺氣通利，痰水下引，進(jìn)而喘可平，腫可退[12]。大棗的作用主要是保護(hù)肺氣，防止藥物對(duì)患者肺氣有損傷，提高治療的安全性[13]。葶藶大棗瀉肺湯臨床上主要用于病毒性肺炎、肺心病、結(jié)核性胸腔積液的治療，且應(yīng)用效果已經(jīng)得到了多方認(rèn)證[14-15]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，但由于其成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)眾多，很難完全闡明其作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論等基本理論趨于一致[16]，在藥物靶點(diǎn)鑒定、有效成分發(fā)現(xiàn)、作用機(jī)理研究、臨床前研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[17]，其主要通過對(duì)復(fù)雜的疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)，以交互式的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控方式來研究整體的病理進(jìn)展。基于中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及其與靶點(diǎn)、疾病之間的相關(guān)信息構(gòu)建藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型[18]，能夠揭示其內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)中藥提高靶標(biāo)療效具有指導(dǎo)意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路，主要運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)、The Human Gene Database(GeneCards)等數(shù)據(jù)庫收集葶藶大棗瀉肺湯治療 COVID-19 的相關(guān)靶點(diǎn)，并運(yùn)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)功能、通路的預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究葶藶大棗瀉肺湯潛在治療 COVID-19 的藥理作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葶藶大棗瀉肺湯主要活性化合物的篩選

口服生物利用度(OB)表示有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度，OB 值越高通常表示藥物的生物活性分子的類藥性(DL)越好。本研究以葶藶子、大棗兩味中藥為關(guān)鍵詞，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為篩選參數(shù)，利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索中藥的主要活性化合物。

1.2 葶藶大棗瀉肺湯主要作用靶點(diǎn)和相關(guān)疾病靶點(diǎn)的收集

通過TCMSP搜索方中主要活性化合物的相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫檢索與COVID-19相關(guān)的基因。通過分析，得到葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19的共同靶點(diǎn)蛋白。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)、化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將葶藶大棗瀉肺湯的主要活性化合物、靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)和 Cytoscape3.6.1 軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)、藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點(diǎn)通路分析

將上述篩選得到的藥物與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html/main/step1)，通過輸入靶基因名稱列表并選定物種為“homo sapiens”，進(jìn)一步點(diǎn)擊Custom analysis設(shè)置參數(shù)分析，選擇GO與KEGG富集分析。

1.5 分子對(duì)接

為進(jìn)一步分析葶藶大棗瀉肺湯對(duì)于COVID-19 的干預(yù)作用，我們將藥物靶點(diǎn)中化合物度值較高的前十種與ACE2進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接方法如下：

(1)小分子和蛋白的處理：使用Sybyl 2.0軟件構(gòu)建中藥單體小分子化合物，并對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，存為mol2文件。從PDB(protein data bank)數(shù)據(jù)庫中下載ACE2的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，蛋白ID為1R4L，利用Sybyl 2.0軟件提取出蛋白中的配體，將無配體蛋白和配體分別保存為PDB文件。

(2)分子對(duì)接：通過混合Lamarckian遺傳算法(LGA)進(jìn)行對(duì)接。在Autodock 4.2軟件中打開無配體蛋白文件，并為其加入電荷。通過配體文件的位置確定蛋白晶體的結(jié)合域，在結(jié)合域處設(shè)定結(jié)合晶格，晶格的xyz軸均為40格點(diǎn)。將小分子mol2文件加入電荷成為pdbqt文件，使用該文件在結(jié)合晶格處與蛋白進(jìn)行虛擬對(duì)接。算法設(shè)定為遺傳算法(genetic algorithm，GA)，四元數(shù)(quaternion)與小分子旋轉(zhuǎn)鍵扭轉(zhuǎn)次數(shù)(torsion)都為30次，運(yùn)行次數(shù)為30輪次，其他設(shè)定均為默認(rèn)值。

(3)對(duì)接結(jié)果分析：將對(duì)接結(jié)果按照結(jié)合能絕對(duì)值進(jìn)行排序，選取結(jié)合能絕對(duì)值最高的構(gòu)象，使用Pymol軟件對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 葶藶大棗瀉肺湯主要活性化合物

通過TCMSP檢索，設(shè)置參數(shù)OB≥30%、DL≥0.18共篩選出主要活性化合物27個(gè)，其中大棗15個(gè)，葶藶子12個(gè)。按照OB值大小排列，表1為葶藶大棗瀉肺湯的活性成分。

表1 葶藶大棗瀉肺湯活性化合物基本信息Table 1 Basic information on active compounds of Tingli Dazao Xiefei decoction

續(xù)表1

2.2 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將表1中27個(gè)主要活性化合物通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)主要活性成分調(diào)控靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，共得到224個(gè)靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖1)，該網(wǎng)絡(luò)總共有19個(gè)節(jié)點(diǎn)和452條邊。其中葶藶子所調(diào)控的相關(guān)靶點(diǎn)主要與細(xì)胞凋亡、炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)，而大棗所調(diào)控的靶點(diǎn)主要參與炎癥反應(yīng)，二者聯(lián)用在突出調(diào)控炎癥反應(yīng)的同時(shí)，也具有調(diào)控氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等方面的作用。分析結(jié)果表明，葶藶子與大棗共同調(diào)控的靶點(diǎn)有45個(gè)(圖2)，其中排名靠前的靶點(diǎn)主要有：前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、鈉通道蛋白5亞單位α(SCN5A)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α(PRKACA)、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1(GABRA1)，主要參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)。因此兩藥共同作用時(shí)，能夠在抗炎方面發(fā)揮協(xié)同增效的作用。

圖1 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖Fig.1 The regulation diagram of compound-target-pathway network

圖2 葶藶-大棗共同調(diào)控靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The targets′ network diagram coregulated by Tingli and Dazao

通過拓?fù)浞治鰠?shù)表(表2)來觀察藥物的主要活性成分調(diào)控的作用程度。由化合物所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的邊數(shù)得知，排名前十的藥物成分主要有槲皮素、山奈酚、小檗堿、異鼠李素、β-谷甾醇等，這些成分可能是葶藶大棗瀉肺湯的主要活性成分。

表2 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰠?shù)表Table 2 Compound-target-pathway network topology analysis parameters

2.3 預(yù)測(cè)葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的靶點(diǎn)

根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索COVID-19的靶點(diǎn)，得到251個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用Venn平臺(tái)將葶藶大棗瀉肺湯的靶點(diǎn)與 COVID-19 的治療靶點(diǎn)取交集，得到39個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 葶藶大棗瀉肺湯治療新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)Venn圖Fig.3 Venn diagram of the targets of COVID-19 treated with Tingli Dazao Xiefei decoction

2.4 葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖3得到的39個(gè)靶點(diǎn)在STRING平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心網(wǎng)絡(luò)圖(圖 4)包含39個(gè)節(jié)點(diǎn)，394條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為20.2，超過平均度值的靶蛋白有20個(gè)，說明這20個(gè)靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，提示葶藶大棗瀉肺湯可能通過調(diào)節(jié)這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療COVID-19的作用。20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)依據(jù)度值由高到低排序，其與炎癥疾病相關(guān)的主要靶點(diǎn)有:腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、C-C基序趨化因子2(CCL2)等。結(jié)果見表 3。

圖4 葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein-protein interaction network diagram of Tingli Dazao decoction and COVID-19

表3 葶藶大棗瀉肺湯 PPI 網(wǎng)絡(luò)中大于平均度值的靶標(biāo)蛋白Table 3 Target proteins with above-average values in PPI network of Tingli Dazao Xiefei decoction

2.5 葶藶大棗瀉肺湯靶點(diǎn)通路分析

將39個(gè)靶點(diǎn)上傳到Metascape數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋，共得到分子功能、生物過程和細(xì)胞成分GO條目232個(gè)，KEGG富集通路146條。根據(jù)P值分別得到排名前20富集柱狀圖(如圖5(a)、6(a)所示)。同時(shí)，根據(jù)相關(guān)度進(jìn)行群集ID著色，如圖5(b)和6(b)，顏色區(qū)分不同類別，且節(jié)點(diǎn)面積與聚集程度成正相關(guān)。將所有靶點(diǎn)進(jìn)行全連接網(wǎng)絡(luò)交互，得到圖5(c)、6(c)，不同顏色表示互作網(wǎng)絡(luò)中可識(shí)別到的子模塊，且節(jié)點(diǎn)面積與富集分析的頻次成正比。

通過分析發(fā)現(xiàn)，GO功能富集主要涉及凋亡信號(hào)途徑、外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)等。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)交互顯著性分析，得到子模塊如圖5(d)所示，細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、MAPK8等為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，在GO富集中起到重要作用。

圖5 葶藶大棗瀉肺湯靶點(diǎn)的 GO 富集分析及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖 Fig.5 GO enrichment analysis and network diagram of targets regulated by Tingli Dazao Xiefei decoction

KEGG通路注釋主要參與調(diào)控IL-17、NF-κB、甲型流感、肺結(jié)核等信號(hào)通路，其中在 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Chagas disease (American trypanosomiasis)，Leishmaniasis，Hepatitis B，Toxoplasmosis五條通路上靶點(diǎn)富集較多。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)交互顯著性分析，得到子模塊如圖6(d)所示，TP53，MAPK1，MAPK14等為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，在治療新型冠狀病毒肺炎中起到藥效作用。

圖6 葶藶大棗瀉肺湯治療 COVID-19 的 KEGG 富集分析及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 KEGG pathway analysis and network diagram of Tingli Dazao Xiefei decoction for the treatment of COVID-19

2.6 葶藶大棗瀉肺湯活性成分以及臨床用藥與ACE2對(duì)接結(jié)果分析

Lopes等[19]報(bào)道血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2(ACE2)是一種促進(jìn)冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)。Willcox等[20]報(bào)道 COVID-19與ACE2結(jié)合，促進(jìn)人體感染。張勇剛等[21]對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明共有5556個(gè)基因能夠被ACE2表達(dá)。本研究對(duì)ACE2的表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有60個(gè)基因能夠受到葶藶大棗瀉肺湯的調(diào)控，提示葶藶大棗瀉肺湯可能通過作用于ACE2，進(jìn)而對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控。因此在本研究中，對(duì)葶藶大棗瀉肺湯中藥主要有效成分進(jìn)行分析，并按照拓?fù)浞治鰧⒍戎蹬琶笆某煞植捎梅肿訉?duì)接的方法與ACE2受體的結(jié)合能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其均與ACE2具有較好的結(jié)合效果。我們對(duì)靶點(diǎn)度值前4的成分進(jìn)行Pymol可視化分析，其中槲皮素、山奈酚、異鼠李素與ACE2具有共同的結(jié)合位點(diǎn)GLU-406；β-谷甾醇的結(jié)合位點(diǎn)為ARG-514；槲皮素的結(jié)合位點(diǎn)GLU-375也已被證明為ACE2的活性位點(diǎn)。因此推測(cè)葶藶大棗瀉肺湯可通過以上位點(diǎn)與ACE2進(jìn)行結(jié)合，從而抑制病毒與ACE2間的相互作用，為葶藶大棗瀉肺湯的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。主要藥物成分與ACE2受體的結(jié)合能見表4，用PyMOL軟件顯示的藥物主要活性成分與ACE2(PDB為1R4L)的分子對(duì)接3D圖譜見圖7。

表4 主要藥物成分與ACE2受體的結(jié)合能表Table 4 Binding energy analysis of main components with ACE2 receptor

圖7 藥物主要活性成分與ACE2的分子對(duì)接3D圖譜Fig.7 3D image of main active components binded with ACE2 receptor

3 討論

COVID-19屬于中醫(yī)理論的“溫病”范疇，其表現(xiàn)為外感溫邪，以發(fā)熱為主癥，易化燥傷陰，易內(nèi)陷生變，具備溫邪致病的特性[22]。病機(jī)表現(xiàn)為“濕、熱、毒、瘀、虛”[23]，由瘟疫論解析可知，其發(fā)病突然，具有一定的傳染性及特異性[24]。在防疫期間COVID-19診療方案里含有葶藶子的處方藥所對(duì)應(yīng)的癥狀分別有：寒濕郁肺癥、濕毒郁肺癥、疫毒閉肺癥、氣營(yíng)兩燔癥。而葶藶大棗瀉肺湯中君藥為葶藶子，因此探究其對(duì)于COVID-19的潛在防疫作用，可以為當(dāng)前的抗疫工作提供一定的基礎(chǔ)支持。

葶藶大棗瀉肺湯組方由葶藶子和大棗組成，葶藶子味苦、辛，具有破堅(jiān)逐邪、通利水道的作用，治療咳嗽氣喘。為防葶藶子性猛峻瀉而傷正氣，故佐以大棗，安中以緩和藥性[25]?，F(xiàn)階段藥理研究中，葶藶子具有止咳平喘、抗菌、抗炎、調(diào)血脂等藥理作用[7]，大棗具有抗氧化、提高免疫、保護(hù)肝臟等作用[26]，葶藶大棗瀉肺湯治療肺炎的主要療效成分與靶點(diǎn)尚不明確。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以中藥有效成分和藥物靶標(biāo)為研究對(duì)象，預(yù)測(cè)藥物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與通路，探討葶藶大棗瀉肺湯對(duì)于COVID-19的潛在靶標(biāo)療效意義。

本研究篩選得到葶藶大棗瀉肺湯的主要活性成分 27 個(gè)，通過藥物靶點(diǎn)分析得到，槲皮素、山奈酚、小檗堿、異鼠李素等化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度較高。槲皮素具有抗病毒、減輕肺臟炎癥、抗氧化等作用，可通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活而改善氣體交換功能，抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[27]。山奈酚具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、疾病預(yù)防等作用[28]，可明顯改善小鼠肺組織X線照射后的炎性滲出，對(duì)放射性肺損傷具有一定的防治作用，并可降低炎性因子TNF-α，IL-6的釋放，抑制NF-κB和MAPK通路的激活，進(jìn)一步阻止炎性因子的生成，最終通過抗炎、抗氧化作用減少組織損傷[29]。大棗中的成分小檗堿可抑制細(xì)胞 TLR4/MyD88 依賴型信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制 NF-κB 激活，顯著減少 NLRP3 炎癥小體的表達(dá)，從而達(dá)到一定的抑制炎癥反應(yīng)作用[30]。綜上所述，預(yù)測(cè)葶藶大棗瀉肺湯可由其主要活性成分調(diào)節(jié)肺部疾病，并進(jìn)一步調(diào)控炎癥反應(yīng)，達(dá)到協(xié)同增效的作用，預(yù)測(cè)其可通過抑制炎癥反應(yīng)對(duì)COVID-19達(dá)到一定的輔助治療效果。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有45個(gè)靶點(diǎn)受到葶藶子與大棗的共同調(diào)控，主要涉及對(duì)NF-κB，p38/MAPK及JAK2/STAT3等信號(hào)通路的抑制，提示葶藶子與大棗配伍使用能夠通過以上靶點(diǎn)發(fā)揮對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用。大棗中的主要成分小檗堿還能夠抑制炎癥小體NLRP3的表達(dá)，與葶藶子配伍后，能夠從不同角度發(fā)揮抗炎作用，增強(qiáng)藥物的抗炎效果，發(fā)揮協(xié)同增效的作用。盡管已有研究證實(shí)葶藶子具有一定的抗炎作用，但其主要通過利水功效減輕肺部損傷[31]。由于葶藶子的藥效過猛，對(duì)機(jī)體的正氣具有一定的損傷，大棗藥性溫和，可緩和葶藶子的藥性，保護(hù)心脾[32-33]，二者配伍使用，在改善機(jī)體功能的同時(shí)[34]，還能增強(qiáng)抗炎的效果，從而對(duì)炎癥風(fēng)暴的產(chǎn)生具有一定的抑制作用，對(duì)COVID-19發(fā)揮防治功效。

同時(shí)對(duì)得到的活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)葶藶大棗瀉肺湯中發(fā)揮主要作用的靶點(diǎn)有39個(gè)，經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)葶藶大棗瀉肺湯干預(yù)COVID-19發(fā)揮主要作用的靶點(diǎn)為TNF，CASP3，MAPK8，MAPK1，CCL2等。TNF可通過提高白細(xì)胞的吞噬能力、氧化爆發(fā)和釋放蛋白酶來加強(qiáng)其對(duì)入侵微生物的殺傷作用，在SARS-CoV感染者急性期血清中 TNF水平與對(duì)照組比較顯著增高，感染控制后TNF有所下降，說明TNF與肺部感染的發(fā)病有關(guān)[35]。MAPK1和MAPK8是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，MAPK通路在控制炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中具有重要作用[36]，據(jù)報(bào)道MAPK信號(hào)通路是病毒RNA合成中高效輸出病毒NP所必需的，抑制該通路則可減少流感病毒的復(fù)制和炎癥癥狀[37]。此外當(dāng)病原體攻擊機(jī)體時(shí)MAPKs與炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)密切相關(guān)，其中趨化因子 CCL2能夠特異性地趨化嗜酸性粒細(xì)胞聚集到氣道黏膜表面，引起支氣管上皮組織的損傷[38]。綜上所述，葶藶大棗瀉肺湯中關(guān)鍵成分可能通過調(diào)控TNF，MAPK，CCL2等靶點(diǎn)而發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)肺損傷，從而輔助治療COVID-19。

研究報(bào)道COVID-19病理檢查發(fā)現(xiàn)肺組織有水腫、蛋白樣滲出物、局灶性反應(yīng)性肺細(xì)胞增生伴斑片狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[39]。由此說明當(dāng)組織受到損傷或者感染，炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵抗病原體的常見方式之一，有助于加強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除作用[40]。促炎和抗炎機(jī)制的平衡對(duì)于維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[41]，若機(jī)體從“自我保護(hù)”演變?yōu)椤斑^度保護(hù)”的狀態(tài)，打破炎癥反應(yīng)的平衡狀態(tài)，使免疫細(xì)胞產(chǎn)生正反饋反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)大量的促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-8等的生成，可觸發(fā)機(jī)體導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)即細(xì)胞因子風(fēng)暴，短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生炎癥因子并對(duì)組織、器官造成嚴(yán)重病理損傷[42]。因此探索葶藶大棗瀉肺湯對(duì)炎癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，及防止細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生具有重要意義。

本研究進(jìn)一步對(duì)有效靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO與KEGG富集分析，得到GO條目232個(gè)，KEGG通路146條，GO富集分析結(jié)果顯示靶點(diǎn)主要富集在凋亡信號(hào)途徑、外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、脂多糖應(yīng)答等。KEGG通路結(jié)果顯示，葶藶大棗瀉肺湯主要涉及IL-17信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、肺結(jié)核等。IL-17信號(hào)通路在自身免疫和感染中誘導(dǎo)病理變化，可通過MAPK與NF-κB等途徑誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF的產(chǎn)生并協(xié)同加重炎癥損傷[43]，在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的血清中檢測(cè)出IL-17，IL-6含量明顯增高[44]，其中IL-6是誘發(fā)炎癥風(fēng)暴的重要通路，當(dāng)機(jī)體的炎癥平衡狀態(tài)被打破，免疫系統(tǒng)在殺死病毒的同時(shí)，也會(huì)殺死大量肺的正常細(xì)胞，嚴(yán)重破壞肺的換氣功能，從而產(chǎn)生“白肺”[45]。表明細(xì)胞因子風(fēng)暴與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，另外IL-17通路的激活對(duì)膿毒癥引起的肺部炎癥起關(guān)鍵作用[46]。NF-κB作為一種涉及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[47]。研究報(bào)道重癥支氣管肺炎組的NF-κB表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，同時(shí)，其上游PI3K/AKT的磷酸化刺激NF-κB的活性增強(qiáng)，產(chǎn)生二聚體入核，從而調(diào)控炎癥因子的合成和釋放，導(dǎo)致血漿中的趨化因子和細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)變化水平，與肺組織病理損傷息息相關(guān)[48]。綜合上述研究結(jié)果，預(yù)測(cè)葶藶大棗瀉肺湯具有抑制促炎因子的表達(dá)，減輕肺部炎性損傷的潛在機(jī)制，還可通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路來抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴的爆發(fā)，可為進(jìn)一步防治COVID-19提供一定的基礎(chǔ)支持。

ACE2受體是一種可溶性的重組蛋白，藥物成分與之結(jié)合后，可以抑制病毒與其活性部位相結(jié)合，從而防止病毒的傳播[49]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，葶藶大棗瀉肺湯中的主要活性成分與ACE2受體的結(jié)合能均遠(yuǎn)小于-25.10 kJ/mol，提示以上成分均與ACE2具有較好的結(jié)合效果。由此可見，藥物活性成分與該受體結(jié)合較為穩(wěn)定，推測(cè)葶藶大棗瀉肺湯可通過與ACE2受體結(jié)合，從而抑制病毒與ACE2間的相互作用，進(jìn)而存在潛在地治療COVID-19的作用。排名前十的成分中6種來源于葶藶子，分別為：β-谷甾醇、蛇床子素、豆甾醇、槲皮素、山奈酚與異鼠李素；另外4種來源于大棗，分別為：(S)-椰油堿、斯特法林、香豆素、小檗堿。表明葶藶子與大棗中的成分均與ACE2具有一定的結(jié)合能力，可共同作用于機(jī)體，進(jìn)而發(fā)揮治療COVID-19的作用。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測(cè)葶藶大棗瀉肺湯對(duì)于COVID-19潛在的治療靶點(diǎn)及調(diào)控通路，得到葶藶大棗瀉肺湯具有潛在抑制機(jī)體產(chǎn)生炎癥風(fēng)暴的作用。本研究為葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的藥效機(jī)制研究提供了初步的預(yù)測(cè)，其確切的機(jī)制仍需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。