梅明，周進(jìn)，黃文濤，馬良鵬，楊明，胡松*

(1.武漢市第一醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430030；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是前列腺的一種良性病變，為老年男子常見的疾病之一?，F(xiàn)階段BHP的治療手段主要為藥物治療和手術(shù)治療，手術(shù)治療雖然效果較好，但仍然存在一定的危險(xiǎn)性和后遺癥，老年人難以接受；化學(xué)藥治療有治療效果不理想和較大不良反應(yīng)的缺點(diǎn)，因此亟需尋找安全有效的藥物。BHP的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為雄激素是引發(fā)和維持BHP的重要因素。中醫(yī)認(rèn)為BHP的主要病理為腎精不足、腎氣衰弱、血行不暢、氣化不利、濁瘀敗精與阻滯尿路，因此，散結(jié)行瘀、通利水道為其治療原則。

蜣螂性寒，味咸，具有破淤、攻毒、定驚、通便等功效，為鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂(CatharsiusmolossusLinnaeus)的干燥體?！侗静菥V目》《千金方》《本草原始》等均有蜣螂用于治療大小便不通、下痢赤白的記載，現(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道也表明，蜣螂可單用或聯(lián)合其他藥物用于治療小便不通、小便血淋等[1-2]。蜣螂破瘀、通小便的功效，針對(duì)前列腺增生的主要病機(jī)[3-4]。上述初步表明蜣螂可改善排尿，具有抗BPH的作用。

本文應(yīng)用丙酸睪酮制造大鼠良性前列腺增生模型，測(cè)定相關(guān)臟器指數(shù)、免疫組化因子等，考察了蜣螂醇提物對(duì)小鼠良性前列腺增生的影響，以期為其合理開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光Cobas e601型免疫分析儀( 羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市金南儀器制造有限公司)；MODEL 680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD 公司)；FA1104型萬分之一電子天平(上海天平儀器廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

蜣螂購于四川成都荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂CatharsiusmolossusLinnaeus 的干燥體。

丙酸睪酮(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)0606301)；注射用青霉素鈉(華北制藥有限股份公司，批號(hào)1105404E)；大鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司)；雙氫睪酮(DHT)酶免試劑盒(美國R&D公司生產(chǎn))；睪酮(T)試劑盒(深圳市拉爾文生物工程技術(shù)有限公司)；雌二醇(E2)試劑盒(深圳市拉爾文生物工程技術(shù)有限公司)；表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(武漢博士德生物工程有限公司)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 蜣螂醇提物的制備

取蜣螂粗粉適量，分別加3倍量75%乙醇、85%乙醇和95%乙醇，浸泡48 h，再分別用10倍量乙醇滲漏，收集滲漏液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮過程中保留所有物質(zhì)，減壓干燥得75%乙醇提取物、85%乙醇提取物與95%乙醇提取物，給藥時(shí)將提取物用適宜溶劑溶解灌胃給藥。

2.2 動(dòng)物分組

取雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、75%乙醇提取物組、85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組。

2.3 動(dòng)物造模與給藥

將空白組大鼠做假手術(shù)處理，其余40只大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液3 mL/kg麻醉，進(jìn)行兩側(cè)睪丸無菌切除，縫合皮膚，肌肉注射青霉素2.0×105U/kg，連續(xù)7 d，每天1次。經(jīng)1周自然恢復(fù)后，除空白組外，其他組大鼠均按10 mg /kg劑量皮下注射丙酸睪丸酮誘發(fā)前列腺組織增生，連續(xù)30 d。從造模第1天起，各實(shí)驗(yàn)組按20 g 生藥每千克的量分別灌胃給予相應(yīng)的75%乙醇提取物、85%乙醇提取物和95%乙醇提取物，空白組與模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥30 d[5-6]。

2.4 動(dòng)物標(biāo)本采集

大鼠末次給藥后禁食12 h，稱量空腹大鼠體重，取血清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清PAP與E2水平。斷頸處死大鼠迅速摘取前列腺，稱重，并計(jì)算前列腺指數(shù)(前列腺指數(shù)=前列腺濕重(g)/大鼠體重(g))。取1/2前列腺組織置于4%多聚甲醛溶液固定，用免疫組化法測(cè)定前列腺組織中EGF，TGF-β1，bFGF及IGF-1陽性表達(dá)，應(yīng)用Image pro plus軟件測(cè)定各生長(zhǎng)因子的平均光密度值(MOD，MOD=累積光密度/積分面積)，每張切片光鏡下取3個(gè)視野。另取1/2前列腺組織，用高速勻漿機(jī)在冰浴上進(jìn)行勻漿，按試劑盒說明書測(cè)定cDHT與ρT水平[7-9]。

2.5 對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

由表1可知，模型組大鼠的前列腺濕重與前列腺指數(shù)顯著高于空白組(P<0.01)，說明造模成功。蜣螂75%乙醇提取物組的前列腺濕重和前列腺指數(shù)與模型組比較，未能體現(xiàn)出顯著差異；85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組的前列腺濕重和前列腺指數(shù)顯著低于模型組，具有極顯著性差異。此外，85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組兩項(xiàng)指標(biāo)相比，沒有顯著性差異。

表1 各組大鼠臟器指數(shù)的比較Table 1 Comparison of prostate index in each group

2.6 對(duì)大鼠血清中ρPAP，ρE2水平和前列腺組織中cDHT，ρT水平的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組ρPAP水平明顯升高，有極顯著性差異，再次說明造模成功[10]。與模型組比較，85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組的大鼠血清中ρPAP，ρE2與前列腺組織中cDHT和ρT水平明顯降低且具有極顯著性差異，75%乙醇提取物組的ρPAP和cDHT水平與模型組相比具有顯著性差異，ρE2和ρT水平與模型組相比未能體現(xiàn)出差異。此外，85%乙醇提取物組的上述各項(xiàng)指標(biāo)水平與95%乙醇提取物組相比，沒有顯著性差異。

表2 各組大鼠ρPAP，ρE2，cDHT及ρT水平的比較Table 2 Comparison of the levels of ρPAP,ρE2,cDHT, and ρT in each group

2.7 對(duì)大鼠前列腺組織中EGF，TGF-β1，bFGF及IGF-1表達(dá)的影響

由表3可知，與模型組相比，85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組的大鼠前列腺組織中EGF，bFGF和IGF-1表達(dá)明顯降低，具有顯著差異；75%乙醇提取物組與模型組相比沒有體現(xiàn)出差異。85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組的大鼠前列腺組織中TGF-β1表達(dá)與模型組比較明顯升高，有顯著差異；75%乙醇提取物組與模型組相比沒有體現(xiàn)出差異。此外，85%乙醇提取物組的上述各因子表達(dá)與95%乙醇提取物組相比，沒有顯著性差異。各組大鼠前列腺組織中EGF，TGF-β1，bFGF與IGF-1免疫組化表達(dá)結(jié)果見圖1。

表3 各組大鼠EGF，TGF-β1，bFGF及IGF-1表達(dá)情況比較Table 3 Comparison of the expression of EGF, TGF-β1, bFGF, and IGF-1 in each group

2.8 對(duì)大鼠前列腺組織形態(tài)的影響

以前列腺體密度、比表面及比膜面為指標(biāo)，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠前列腺進(jìn)行立體計(jì)量學(xué)測(cè)定分析，結(jié)果見表4。與模型組相比，85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組大鼠的前列腺體密度明顯降低和比膜面明顯升高，具有顯著性差異；75%乙醇提取物組與模型組相比，沒有體現(xiàn)出差異。85%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組大鼠的比表面明顯升高，與模型組比較具有極顯著性差異；75%乙醇提取物組與模型組相比也有升高，有顯著差異。此外，85%乙醇提取物組的上述各因子表達(dá)與95%乙醇提取物組相比，沒有顯著性差異。

表4 各組大鼠前列腺體密度、比表面及比膜面比較Table 4 Comparison of density, specific surface area, and specific membrane surface area of the prostate gland

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于《本草綱目》《千金方》等本草文獻(xiàn)的挖掘，利用現(xiàn)代技術(shù)，揭示蜣螂醇提物抗良性前列腺增生的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜣螂85%乙醇提取物和95%乙醇提取物在實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)上未能體現(xiàn)出差異，蜣螂85%乙醇提取物便能明顯降低前列腺濕重與前列腺指數(shù)，顯著降低血清中ρPAP與ρE2水平，顯著降低前列腺組織中cDHT，ρT水平，顯著降低EGF，bFGF及IGF-1平均光密度，明顯升高TGF-β1平均光密度。通過對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠前列腺進(jìn)行立體計(jì)量學(xué)測(cè)定分析表明，蜣螂85%乙醇提取物能顯著降低前列腺體密度，升高比表面與比膜面值，這提示蜣螂85%乙醇提取物即具有抗良性前列腺增生作用。

蜣螂85%乙醇提取物經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研與初步實(shí)驗(yàn)研究分析，可知效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)為多肽類物質(zhì)，其與另外兩組提取物可能在多肽的組成(氨基酸種類)與多肽分子量大小方面存在較大差異[11]。此外，蜣螂85%乙醇提物具有良好的抗良性前列腺增生的作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)EGF，TGF-β1，bFGF及IGF-1的表達(dá)有關(guān)。

本文通過對(duì)蜣螂抗良性前列腺增生機(jī)制的研究，證實(shí)了其具有抗良性前列腺增生的作用，但沒有對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)做明確研究，因此下一步還需要開展相關(guān)的工作。