殷欣，孟藝偉，趙麗婭，齊君，夏雪奎，高翠玲

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103; 2. 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250102)

室內(nèi)空氣環(huán)境質(zhì)量與城市人群健康密切相關(guān)。成年人約80%～90%的時(shí)間是在室內(nèi)度過(guò)的，而在城市中一些行動(dòng)不便的老人、嬰兒等在室內(nèi)的時(shí)間可能高達(dá)95%[1]。室內(nèi)空氣若發(fā)生微生物污染，易引起人們(特別是免疫力低下的老人和嬰幼兒)出現(xiàn)頭疼、呼吸道感染[2]、惡心、過(guò)敏、皮炎等癥狀。形成室內(nèi)空氣細(xì)菌污染的原因一般是通風(fēng)不好，并且室內(nèi)人員較多，更容易滋生致病微生物。此外，室內(nèi)通風(fēng)系統(tǒng)的微生物污染也是導(dǎo)致室內(nèi)微生物超標(biāo)的重要原因[3]。因此，研究室內(nèi)空氣的微生物群落結(jié)構(gòu)變化將對(duì)人們的身體健康起到警示和保障作用。

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，主要通過(guò)將微生物培養(yǎng)后依據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)、生態(tài)學(xué)特征等進(jìn)行鑒別。Orji等[4]指出這種方法只能檢測(cè)出約1%的重要病原菌，而利用宏基因組學(xué)、高通量測(cè)序、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析等技術(shù)，自然界中100%的致病菌都能得到研究。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，已成為研究大氣、水、油井等環(huán)境樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要手段[5-7]。

隨著人們對(duì)空氣質(zhì)量與健康關(guān)系認(rèn)識(shí)地不斷加深，如何將室內(nèi)空氣中的雜質(zhì)去除以提高空氣質(zhì)量也受到研究者的關(guān)注。Zhao等[8]通過(guò)多級(jí)過(guò)濾去除了室內(nèi)空氣中大量的灰塵、微生物等雜質(zhì)，從而提高了空氣質(zhì)量。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)進(jìn)入到各種場(chǎng)所，如商場(chǎng)、醫(yī)院、幼兒園、家庭等。然而新風(fēng)系統(tǒng)的興起時(shí)間較短，人們對(duì)于該系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還不夠全面，例如是否能夠高效凈化空氣，保障室內(nèi)空氣的持續(xù)高質(zhì)量而不引發(fā)空氣的二次污染等。目前針對(duì)室內(nèi)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)，利用測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，從而探討室內(nèi)空氣的微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道。本文收集了在濟(jì)南歷城地區(qū)使用的新風(fēng)系統(tǒng)空氣濾膜所積累的微生物為樣本，利用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌豐度檢測(cè)，以期掌握該地區(qū)室內(nèi)細(xì)菌的主要組成成分，并分析潛在的細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

濟(jì)南市歷城區(qū)某全國(guó)連鎖幼兒園，截至2018年11月31日使用了不同時(shí)間的新風(fēng)系統(tǒng)中的超細(xì)玻璃纖維空氣濾膜，分為3個(gè)樣本組，每個(gè)樣本組含有3個(gè)重復(fù)樣本(表1)。所有樣本裝入無(wú)菌采樣袋中，在4 ℃條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)處理。

表1 不同使用時(shí)間的空氣濾膜樣本編號(hào)Table 1 Numbers of air-filtration membrane samples used in different time

1.2 樣本處理

(1)每個(gè)樣本取15～20片空氣濾膜剪碎，分裝入含有0.9%生理鹽水的50 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃，200 g離心2 h；(2)輕輕渦旋，用0.22 μm MCE微孔濾膜(貨號(hào)：F513134-0001-生工)過(guò)濾；(3)收集微孔濾膜，剪碎后用于提取樣本的宏基因組DNA。DNA提取采用DNeasy Power Soil Kit(貨號(hào)：12888-50-QIAGEN)。

1.3 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序

各樣本的宏基因組DNA用無(wú)菌水稀釋至終濃度1 ng/μL，并以此為模板，利用16S V3-V4區(qū)通用引物(F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(Thermofisher公司)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，經(jīng)過(guò)定量和檢測(cè)后進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序方法為單端測(cè)序(single-end)法。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt v1.9.1先對(duì)reads進(jìn)行初步處理得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，然后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)。利用Uparse v7.0.1001對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)成為操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTU)，同時(shí)會(huì)選取OTU的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列；對(duì)OTU序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肕othur方法與SILVA132[10]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，獲得分類(lèi)學(xué)信息并分別在各個(gè)分類(lèi)水平：kingdom(界)，phylum(門(mén))，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成；使用MUSCLE v3.8.31軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTU序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[11]。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序得到的有效數(shù)據(jù)數(shù)目在45 878～64 178范圍內(nèi)，平均長(zhǎng)度395～415 nt，有效數(shù)據(jù)中堿基質(zhì)量值大于20(測(cè)序錯(cuò)誤率小于1%)的堿基所占的百分比(Q20)超過(guò)82%，數(shù)據(jù)得率90%以上。3個(gè)樣本組的測(cè)序深度均超過(guò)99.9%，理論上測(cè)序數(shù)據(jù)已覆蓋樣本中的全部序列。

2.2 OTUs聚類(lèi)分析

在97%相似性水平上進(jìn)行聚類(lèi)，3個(gè)樣本組共有OTU數(shù)量達(dá)1015個(gè)，樣本組JN6，JN9和JN12特有的OTU數(shù)量分別為303，484和274個(gè)(圖1)?；贠TU的物種分類(lèi)分析，細(xì)菌種類(lèi)覆蓋31個(gè)門(mén)725個(gè)屬。其中，樣本組JN9中特有的OTU數(shù)目最多，預(yù)示含有較多的特有微生物種類(lèi)。

圖1 OTU維恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU

2.3 門(mén)水平Top10物種相對(duì)豐度及優(yōu)勢(shì)物種差異分析

對(duì)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)鶕?jù)物種注釋結(jié)果，選取3個(gè)樣本組在門(mén)(phylum)分類(lèi)水平上最大豐度排名前10的物種進(jìn)行物種相對(duì)豐度和優(yōu)勢(shì)物種差異分析(圖2)，結(jié)果顯示各樣本中以變形菌門(mén)(Proteobacteria)(占比27%～54%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(占比13%～30%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)(占比12%～30%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(占比4%～10%)的微生物居多，4種細(xì)菌門(mén)總豐度平均為90%。許多對(duì)人體有害的微生物如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、幽門(mén)螺桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等都屬于這些種類(lèi)[12-13]。在生活環(huán)境中，變形菌門(mén)細(xì)菌比較常見(jiàn)，即使經(jīng)過(guò)消毒殺菌，其再生能力仍然較強(qiáng)[14]。厚壁菌門(mén)細(xì)菌即使處于一些抗生素環(huán)境中也具有較強(qiáng)的生命力[15]。放線菌中絕大多數(shù)是有益菌，也有極少數(shù)會(huì)引起人類(lèi)的疾病。擬桿菌門(mén)的一些細(xì)菌可以釋放細(xì)胞神經(jīng)毒素從而使人體發(fā)生炎癥性神經(jīng)變性，甚至已經(jīng)可以作為某些環(huán)境下的污染指標(biāo)[16-17]。隨著使用時(shí)間的增加，3個(gè)樣本組中變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)這4類(lèi)菌之間的豐度比例相對(duì)變化不明顯，但總豐度由85%上升至95%，分析可能是該地區(qū)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期變化不大，且持續(xù)污染程度較嚴(yán)重，使得空氣中微生物含量豐富導(dǎo)致的這種現(xiàn)象，所以該地區(qū)室內(nèi)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)濾膜中致病菌存在的可能性較大，可能會(huì)出現(xiàn)微生物的二次污染情況。

圖2 門(mén)水平上Top10物種相對(duì)豐度柱形圖Fig. 2 Bar chart of relative abundance of top 10 species at phylum level

2.4 屬水平Top100物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及Top10物種相對(duì)豐度分析

變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)中所含菌屬種類(lèi)明顯居多(圖3)。在3個(gè)樣本組中，甲基桿菌屬(Methylobacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、副球菌屬(Paracoccus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和藍(lán)細(xì)菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌屬(圖3)。其中，甲基桿菌屬、雙歧桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不確定藍(lán)細(xì)菌屬的微生物一般是室內(nèi)經(jīng)常檢出的優(yōu)勢(shì)菌群[18]。此外，樣本組JN12中還特別富含萊茵海默氏菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)和不動(dòng)桿菌屬的微生物(圖4)。其中不動(dòng)桿菌屬中一些微生物是條件致病菌，如鮑曼不動(dòng)桿菌，該菌是臨床上最常見(jiàn)的一種條件致病菌，通常會(huì)引起腹膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、菌血癥和肺炎等[19]。Wu等[20]利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶粉生產(chǎn)線室內(nèi)空氣進(jìn)行了微生物多樣性檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌、蠟樣芽胞桿菌、科氏葡萄球菌等一些致病菌。由于JN12中不動(dòng)桿菌屬微生物占有較高的豐度，因此推測(cè)該地區(qū)的空氣凈化系統(tǒng)在使用12個(gè)月時(shí)存在微生物二次污染的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)引起居民的注意。

圖3 屬水平上Top10物種相對(duì)豐度柱形圖Fig. 3 Bar chart of relative abundance of top10 species at genus level

分支和扇形的顏色表示其對(duì)應(yīng)的門(mén)；扇環(huán)外側(cè)的堆積柱形圖表示該菌屬在不同樣本中的豐度分布信息。圖4 屬水平Top100物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.4 Top100 species phylogenetic relationships at genus level

2.5 不同使用時(shí)間對(duì)優(yōu)勢(shì)物種的影響

通過(guò)分析3組樣本組之間的優(yōu)勢(shì)菌屬和種的差異(圖5)，我們?cè)趯俸头N分類(lèi)水平下，選取平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖(ternary plot)。由圖5(a)可知，隨著空氣濾膜使用時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的菌屬優(yōu)勢(shì)也在發(fā)生變化，逐漸由不確定藍(lán)細(xì)菌屬、雙歧桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬向芽孢桿菌屬、副球菌屬過(guò)渡，最后不動(dòng)桿菌屬和萊茵海默氏菌屬微生物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在種水平上(圖5(b))，從使用時(shí)間6個(gè)月到12個(gè)月，由Loliumperenne，Methylobacteriumaquaticum，Bambusaoldhamii和Pelomonaspuraquae向Sphingomonasphyllosphaerae，Bifidobacteriumadolescentis，Moraxellaosloensis，Clostridiumpapyrosolvens和Kocuriarosea過(guò)渡，最后Acinetobacterjohnsonii占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中，使用時(shí)間為9個(gè)月的樣本中含有奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)。該菌為條件致病菌，可引起臨床上原發(fā)性和繼發(fā)性感染，如結(jié)膜炎、中耳炎、腦膜炎、腎炎、支氣管炎和關(guān)節(jié)炎等[12,21]。以上結(jié)果預(yù)示著該地區(qū)的室內(nèi)空氣中存在著一些致病菌，通過(guò)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)過(guò)濾后累積于濾膜上，若濾膜的使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易發(fā)生微生物二次污染，影響居民的身體健康。

圖5 樣本的優(yōu)勢(shì)屬和種的差異Fig. 5 Differences of dominan tgenus and species in samples

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本16S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序，可以獲得準(zhǔn)確的序列信息和更大的數(shù)據(jù)量，從而在后續(xù)分析中獲得更加深入、全面和可靠的結(jié)果。將此技術(shù)引入室內(nèi)空氣凈化系統(tǒng)的細(xì)菌多樣性分析中，可以提供更加詳實(shí)準(zhǔn)確的信息。通過(guò)分析濟(jì)南市歷城地區(qū)室內(nèi)新風(fēng)凈化系統(tǒng)隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)室內(nèi)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)室內(nèi)空氣中微生物含量較豐富，群落結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期變化不大，并且空氣中存在條件致病菌，如奧斯陸莫拉氏菌等。該地區(qū)室內(nèi)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)使用12個(gè)月時(shí)存在一定的微生物二次污染風(fēng)險(xiǎn)。