江蘇省淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，淮安223001

利伐沙班 （Rivaroxaban） 化學(xué)名為5-氯-N-（（（5S）-2-氧代-3-（4-（3-氧代-4-嗎啉基） 苯基）-1，3-惡唑烷-5-基）甲基）-2-噻吩甲酰胺[1]，分子式為C19H18ClN3O5S，是一種口服的抗凝血藥物，它通過(guò)高選擇性直接抑制Xa 因子達(dá)到抑制凝血酶產(chǎn)生和血栓形成的作用，與傳統(tǒng)抗凝血藥物相比，具有服用方便、起效迅速、安全性高等特點(diǎn)[2]。

在利伐沙班合成中，用到雷尼鎳作為催化劑[3]，鎳及其鹽類的毒性較低，但由于它本身具有生物化學(xué)活性，故能激活或抑制一系列的酶（精氨酸酶、羧化酶、酸性磷酸酶和脫羧酶）而發(fā)揮其毒性。長(zhǎng)期接觸（如冶煉鎳、鍍鎳等）、吸入或注射鎳化物，均有致癌作用。歐洲藥物評(píng)審組織（EMEA）將金屬催化劑按風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別分類管理，鎳作為第1 類金屬，規(guī)定注射用原料藥中不得超過(guò)1 μg·g-1[4]。

藥物中鎳含量的測(cè)定方法主要有火焰原子吸收法、石墨爐原子吸收法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。本研究采用微波消解法進(jìn)行樣品前處理，建立了石墨爐原子吸收法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法兩種方法測(cè)定利伐沙班中殘留的鎳，并作比較分析，為藥物中痕量鎳的測(cè)定提供參考。

1 石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定利伐沙班原料藥中鎳殘留

1.1 儀器與藥品、試劑

1.1.1 儀器 安東帕微波消解儀（奧地利安東帕公司）；Aglient 240AAS 原子吸收分光光度計(jì)、Aglient PSD120 可編程進(jìn)樣器、鎳空心陰極燈（均美國(guó)安捷倫公司）；BP211 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.1.2 藥品與試劑 利伐沙班（某藥廠提供）批號(hào)為20151001、20151002、20151003、20151004、150401、150402；鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1，中國(guó)計(jì)量研究院，批號(hào)：16041）；硝酸；超純水。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 儀器工作條件 檢測(cè)波長(zhǎng)：232.0 nm，狹縫：0.2 nm；燈電流：4.0 mA；背景校正：塞曼；石墨爐原子吸收光譜儀進(jìn)樣體積為20.0 μL，重復(fù)測(cè)定次數(shù)：3次。石墨爐升溫參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 取鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液 ［C （Ni）=100 μg·mL-1］1 mL 置50 mL 量瓶中，加2%稀硝酸制成含鎳2 μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；取儲(chǔ)備液5 mL 置100 mL 量瓶中，加2%稀硝酸溶液制成含鎳100 μg·L-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約0.2 g，精密稱定，置消解罐中，加硝酸10 mL，放置過(guò)夜，按表2 升溫程序進(jìn)行微波消解，待消解結(jié)束后，取出消解罐并加熱，揮去大部分酸液（殘液約1 mL），將消解罐中的殘液轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，用超純水稀釋至刻度，得供試品溶液。同法制備空白溶液。

表1 石墨爐升溫程序

表2 微波消解條件

1.2.4 線性與范圍 鎳貯備液的配制以“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液為母液，采用自動(dòng)配標(biāo)方式，按“1.2.1”項(xiàng)下的條件以0、10、30、50、80、100 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以濃度對(duì)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=5.81×10-3X+2.707×10-2、r=0.999 6，結(jié)果表明，利伐沙班中鎳元素含量的線性范圍：0～100 μg·L-1。

1.2.5 回收率 精密稱取每份約0.2 g 利伐沙班（批號(hào)為20151001） 共9 份，分別加入含鎳量為0.8、1.0、1.2 μg 的硝酸10 mL，每個(gè)濃度3 份，按“1.2.3”項(xiàng)下樣品處理方法進(jìn)行前處理，并按“1.2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率為112.0%，RSD 為4.7%。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL 置50 mL 量瓶中，加2%稀硝酸溶液制成含鎳40 μg·L-1的溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的條件，平行測(cè)定6次，平均值為40.66 μg·L-1，RSD 為1.6%（n=6）。

1.2.7 檢測(cè)限與定量限 分別按公式LOD=3.3σ／S、LOQ=10σ／S，確立檢測(cè)限與定量限。

其中σ 為對(duì)空白溶液連續(xù)進(jìn)行11 次測(cè)定的響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（參照《中國(guó)藥典》2015 年版四部9101）。計(jì)算最低檢測(cè)濃度為1.9 μg·L-1，分析方法的檢測(cè)限為0.2 μg·g-1；最低定量濃度為5.9 μg·L-1，分析方法的定量限為0.7 μg·g-1。

1.2.8 樣品測(cè)定 取利伐沙班6 個(gè)批號(hào)樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，并按“1.2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果匯總表

2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定利伐沙班原料藥中鎳殘留

2.1 儀器與藥品、試劑

2.1.1 儀器 安東帕微波消解儀（Multiwave3000奧地利安東帕公司）；NexION 300 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；BP211 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

2.1.2 藥品與試劑 利伐沙班由同一廠家提供，批號(hào)同“1.1.2”；鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg·mL-1，中國(guó)計(jì)量研究院，批號(hào)：16041）；鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg·mL-1，PE 公司，批號(hào)：CL12-143YPY1）；調(diào)諧液（PE 公司）；硝酸；超純水。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 微波消解程序 消解條件同表2。

2.2.2 ICP-MS 測(cè)試條件 發(fā)射功率：1.1kW；采樣錐：鎳錐；霧化器：旋流霧室霧化器；霧化氣流速：0.9 L·min-1；等離子體氣（氬氣）：15.0 L·min-1；輔助氣（氬氣）：1.2 L·min-1；碰撞氣（氬氣）：3.0 L·min-1；掃描方式：跳峰；測(cè)量點(diǎn)／峰：3 點(diǎn)。掃描質(zhì)量數(shù)：待測(cè)元素鎳60，內(nèi)標(biāo)元素Ge 為74。進(jìn)樣方式：手動(dòng)進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)元素Ge 通過(guò)T 型三通管在線引入等離子體。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液［C（Ni）=100 μg·mL-1］適量，加2%稀硝酸溶液制成含鎳1 μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用2%稀硝酸溶液稀釋制成0.5、1、5、10、20 ng·mL-1的系列濃度對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 同“1.2.3”。

2.2.5 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%稀硝酸溶液稀釋制成50 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 線性與范圍

取“2.2.3”項(xiàng)下系列濃度對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣測(cè)定，以鎳元素每秒計(jì)數(shù)（CPS）與內(nèi)標(biāo)鍺元素的每秒計(jì)數(shù)（CPS）的比值為縱坐標(biāo)，每個(gè)對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.289X-7.1×10-2（r=0.999 7）。

結(jié)果表明，利伐沙班鎳元素含量的線性范圍：0.5～20 μg·L-1。

2.4 回收率試驗(yàn)

精密稱取利伐沙班（批號(hào)20151001）約0.2 g，計(jì)9 份，分別加入含鎳量為0.125、0.25、0.375 μg 的硝酸溶液10 mL，每個(gè)濃度3 份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，并按“2.2.2”項(xiàng)下的條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率為97.90%、RSD 為1.8%。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3” 項(xiàng)下10 μg·L-1的鎳對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下的條件平行測(cè)定6 次，平均值為10.10μg·L-1、RSD=0.5%（n=6）。

2.6 檢測(cè)限設(shè)定

儀器自動(dòng)最低檢測(cè)濃度為0.056 μg·L-1，分析方法的檢測(cè)限為0.007 μg·g-1。

2.7 樣品測(cè)定

取利伐沙班6 批，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，并按“2.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了石墨爐原子吸收法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法兩種方法，分別測(cè)定利伐沙班中殘留的鎳。在方法建立初期研究取樣量時(shí)，參考了一般藥品取樣量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)取樣0.5 g 時(shí)，消解完溶液呈深黃色，略不透明，因此判斷需要調(diào)整取樣量或是消解程序，分別試驗(yàn)了取樣0.1、0.2、0.3、0.4 g 以及調(diào)整微波消解的功率和保持時(shí)間。功率過(guò)小則需延長(zhǎng)保持時(shí)間，功率加大雖然可以縮短保持時(shí)間，但消解樣品時(shí)容易壓力過(guò)高；減少取樣量雖然可以消解完全，但是過(guò)少則沒(méi)有代表性，經(jīng)試驗(yàn)取樣0.1～0.3 g 時(shí)，用“2.2.1”的消解程序完全消解且溶液澄清透明。

根據(jù)6 批樣品的檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法對(duì)結(jié)果的測(cè)量無(wú)明顯差異；但電感耦合等離子體質(zhì)譜法由于具有分析速度快、檢測(cè)限更低、靈敏度高以及可多種元素同時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在重金屬痕量分析檢測(cè)方面更具優(yōu)勢(shì)。