許小英，周存敏，譚榜云，陳 琳，朱海平

蘭州大學第一醫(yī)院檢驗科，蘭州730000

黃芪多糖（APS）是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等多種酸性多糖組成的親水性大分子混合物[1]。這種大分子物質很難穿透細胞膜或只有很少部分通過細胞間隙被吸收[2]，導致APS 藥效不顯著。目前臨床上主要以靜脈方式給藥，尚存在不明確的過敏風險。口服給藥是中醫(yī)藥常用的經典而有效的途徑，也是患者最易接受的給藥方式，但APS 自帶負電荷，口服給藥會造成其與腸黏膜形成靜電排斥，嚴重阻礙其在胃腸道的滲透作用，導致生物利用度更低[3]。尋求促進親水大分子中藥吸收的方法成為研究的焦點。

近年來，借助納米粒子（NPs）較強的細胞穿透和靶向能力、高效的藥代動力學、良好的生物相容性等優(yōu)勢，納米中藥制劑已成為一種很有前途的新型藥物[4]。納米中藥制劑是利用納米載體粒徑小、比表面積大、表面活性高、吸附能力強等特性，通過物理或化學作用，將中藥吸附或包埋在納米粒子上構成的復合物。該復合物具有主動或被動靶向作用，使藥物聚積于病灶部位，顯著提高藥物的生物利用度，且在保證藥物效應的前提下可降低給藥劑量，從而減輕或避免中藥的毒副反應[5]。殼聚糖（CS）納米粒子（以下簡稱CS-NPs）是一種常用的中藥納米制劑的載體。

本實驗主要以CS-NPs 為載體制備APS 納米粒，有望成為臨床治療的新工具。首先確定APS-CS NPs 制備的最佳條件，再按照文獻方法檢測該納米粒的紅外吸收光譜、粒徑、Zeta 電位、分散指數等數據,以表征其大小、分布及穩(wěn)定性等物理特性[6]。最后將APS-CS NPs 與大鼠心肌細胞系（H9c2 細胞）共培養(yǎng)，利用細胞活力變化評價該藥物的細胞相容性，為該藥物臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪多糖（APS）BR，90%（Sigma，美國）；殼聚糖（CS，脫乙酰度≥90%,細度80 目（濟南海得貝海洋生物工程有限公司）；三聚磷酸鈉（TPP，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；高糖DMEM 干粉、培養(yǎng)基胎牛血清（均GIBCO 公司，美國）；H9c2 細胞細胞株（ATCC 細胞庫，美國）。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZS 粒度分析儀（馬爾文公司，英國）；紫外可見分光光度計（日本電子公司）；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（SANYO 公司，日本）；RT-6000 酶標儀（深圳雷杜生命科學股份公司）；SPECTRUM 1000紅外光譜儀（Pontypool，英國）；BI-2005M 激光光散射儀（布魯克海文公司，美國）。

1.3 APS-CS NPs 的制備

1.3.1 確定CS 和TPP 濃度 不同濃度的CS 和TPP,形成納米載體的粒徑不同。在磁力攪拌下，將0.5～2 mg·mL-1的TPP 溶液分別逐滴加入不同濃度的CS 溶液中（1～2.5 mg·mL-1），滴加完畢后繼續(xù)攪拌10 min，所得納米水分散體的粒徑用激光粒度分析儀測定,即可確定最小粒徑時CS 和TPP 的濃度。

1.3.2 確定APS 含量 不同含量的APS 會影響APSCS NPs 納米粒的包封率，確定包封率達到最高時APS 的投入量，以獲得最佳包封率的APS-CS NPs 納米粒。將不同含量的APS（2.5～20 mg）分別加入CSNPs 納米水分散體系，室溫下磁力攪拌過夜。16000r·min-1超速離心60 min 后，取上清液0.5 mL，用95%的乙醇溶解定容于10 mL 量瓶中，用于游離APS 量的測定。游離APS 量測定方法如下：在200～800 nm范圍內用紫外可見分光光度計進行掃描，確定上清液中游離APS 的最大吸收波長，然后在該波長下測定同體積不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL-1）APS 標準溶液和上清液游離APS 的吸光度值，通過APS 標準曲線的線性回歸方程，計算上清液游離APS 吸光度值所對應的濃度值，即為上清液中游離APS 的濃度。應用下述公式計算APS-CS NPs 納米粒的包封率 （encapsulating capacity，EE）：EE%=（m總APS投入量-m上清游離APS量）/m總APS投入量×100%。

1.3.3 采用最佳工藝制備APS-CS NPs 納米粒 按照上述確定的CS 及TPP 濃度，分別配制殼聚糖溶液及TPP 溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，在磁力攪拌下，將TPP 溶液逐滴加入殼聚糖醋酸溶液中，滴加完畢再繼續(xù)攪拌10 min，然后加入上述確定濃度的APS，室溫下磁力攪拌過夜，超速離心（16000 r·min-1）60 min，棄上清液，沉淀物用75%乙醇、蒸餾水各洗3 遍，將得到的沉淀物于-80 ℃冷凍24 h 后，再用真空冷凍干燥機干燥成粉末，備用。

1.4 APS-CS NPs 的理化性質表征

1.4.1 紅外光譜分析 通過比較APS、CS-NPs 納米載體、APS-CS NPs 納米粒紅外光譜吸收峰的差別，判斷APS 是否成功包埋在CS-NPs 納米載體上。取干燥的APS、CS-NPs 納米粒子、APS-CS NPs 納米粒各2.0 mg，用瑪瑙研缽研細，加入100～200 mg 磨細的干燥溴化鉀粉末，混和均勻裝入模具內，在壓片機上壓制成片，用傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜分析，并應用origin 8.0 軟件繪制紅外光譜圖。

1.4.2 平均粒徑測定 應用激光粒度分析儀測定制備的APS-CS NPs 納米粒的平均大小及分布。將凍干的APS-CS NPs 納米粒分散在去離子水中，超聲分散均勻，用激光粒度分析儀測定納米粒粒徑，得到粒徑分布圖。

1.4.3 Zeta 電位測定 采用Zeta 電位儀測定APSCS NPs 納米粒的Zeta 電位，分析該納米粒所帶電荷。將凍干的APS-CS NPs 納米粒分散在去離子水中，超聲分散均勻，用Zeta 電位儀分別檢測APS-CS NPs 納米粒的Zeta 電位。

1.5 細胞相容性評價

為驗證APS-CS NPs 納米粒是否具有細胞毒性，將濃度為10～50 μg·mL-1的APS-CS NPs 納米粒與H9c2 細胞共同培養(yǎng)24、48、72 h 后，分析細胞增值率變化，評價該藥物的細胞相容性。常規(guī)培養(yǎng)H9c2 細胞于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中，并置于溫度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)2天后，取對數生長期細胞，調整細胞濃度為5×104個/孔，接種至96 孔板上，每孔加入100 μL，培養(yǎng)4 h后待細胞貼壁后，將所得細胞分為實驗組和對照組，分別向實驗孔加入終濃度為10～50 μg·mL-1的APS-CS NPs 納米粒，對照孔則加入等體積的PBS，兩組細胞均培養(yǎng)24、48、72 h。然后每孔加入10 μL MTT（0.5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，去除上清液,每孔加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min 使結晶充分溶解，采用酶標儀在570 nm 波長處測定每孔光吸收值（Optical Density，OD），重復3 次，每次做5 個復孔取平均值。將對照組的細胞增值率定為100%，細胞增值率（%）＝（A對照組－A實驗組）/A對照組×100%。

1.6 統(tǒng)計學處理

以SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行結果分析，所有的實驗數據均采用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同條件對APS-CS NPs 納米粒粒徑及包封率的影響

2.1.1 CS 和TPP 濃度對制備的APS-CS NPs 納米粒粒徑的影響 在CS-NPs 納米載體制備過程中，CS 和TPP 濃度對能否形成納米粒，以及形成的納米粒的粒徑有較大影響，見表1。

表1 CS 和TPP 濃度對納米粒粒徑的影響

當加入的CS 濃度小于2 mg·mL-1、TPP 濃度為0.5mg·mL-1時，生成的納米粒子數量太少，溶液清亮。當CS 濃度為2.5mg·mL-1、加入的TPP 濃度為2 mg·mL-1時，CS-NPs 出現聚集，形成絮狀沉淀。而不同濃度的CS 和TPP 形成的CS-NPs 納米粒的平均粒徑差異較大，CS-NPs 納米載體的粒徑并沒有隨著CS 和TPP 濃度的增大而增大，且規(guī)律性不強。但綜合考慮減小粒徑可形成較多的納米載體，以利于對藥物的包封，故選擇納米載體平均粒徑最?。?7.4±3.16）nm 時，CS 濃度為2mg·mL-1，TPP 濃度為1mg·mL-1做下一步研究。

2.1.2 APS 濃度對制備的APS-CS NPs 納米粒包封率的影響 考察不同APS 濃度對APS-CS NPs 納米粒包封率的影響，確定最大包封率時APS 的投入量。首先應用紫外分光光度法確定APS 紫外吸收波長，對APS 標準溶液在200～800 nm 進行全波段掃描，在275 nm 處產生最大吸收峰，無干擾峰存在，因此選定275 nm 作為APS 紫外吸收波長。然后在此波長下，測定0.02～0.10 mg·mL-1APS 標準液的吸光度，以峰面積A 對濃度C 做線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=0.715C-0.0017，r2=0.9990，結果顯示，APS在0.02～0.10 mg·mL-1線性良好。最后根據公式計算包封率，結果顯示，當APS 用量小于10 mg 時，包封率隨APS 用量增大急劇升高，CS 與TPP 離子凝膠化過程中對APS 的捕捉率也相應提高；而當用量繼續(xù)增大時，包封率又有所下降；當APS 投藥量為10 mg時，得到的包封率最高，為89.20%。見圖1。

綜上所述，制備APS-CS NPs 納米粒的最佳工藝條件是：CS 濃度為2 mg·mL-1，TPP 濃度為1 mg·mL-1，APS 濃度為1 mg·mL-1。

2.2 APS-CS NPs 納米粒物理特征

2.2.1 紅外吸收光譜 通過解析APS、CS-NPs 納米載體、APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜差異，可判斷APS 是否結合在CS-NPs 納米載體上。如圖2 所示，APS-CS NPs 納米粒紅外光譜圖的特征頻率：2934.6、1637.9、1537.6、1228.3、1094.7、618.3 cm-1。其中，2934.6 cm-1是CH2反對稱伸縮吸收峰，1637.9 cm-1是C=C 伸縮吸收峰，1537.6 cm-1是NH3+對稱變角吸收峰，1228.3 cm-1是C-O-C （酯） 反對稱伸縮吸收峰，1094.7 cm-1是C-O 伸縮吸收峰，618.3 cm-1為CO2剪式振動吸收峰。與CS-NPs 納米載體的紅外光譜圖相比，特征吸收峰基本一致，但APS-CS NPs 納米粒在618.3 cm-1出現特征吸收峰，對照APS紅外吸收光譜，可知此處為APS 特征性吸收峰，由此可以推斷：CS-NPs 納米載體中含有APS，APS-CS NPs 納米粒制備成功。

2.2.2 納米粒平均粒徑 選擇CS 濃度為2mg·mL-1、TPP 濃度為1 mg·mL-1、APS 為10 mg 的條件下，制備的APS-CS NPs 納米粒水分散體系經激光粒度分析儀測定，確定該納米粒的粒徑大小及粒徑分布。從圖3 可以看出，APS-CS NPs 納米粒的平均粒徑為112.4 nm，粒徑分布比較均一。

2.2.3 Zeta 電位 采用Zeta 電位儀測定APS-CS NPs 納米粒的Zeta 電位，分析該納米粒所帶電荷，結果如圖4 所示，APS-CS NPs 納米粒表面帶正電荷，電位為（41.0±0.21）mV，粒度穩(wěn)定性較好。

2.3 APS-CS NPs 納米粒具有良好的細胞相容性

采用MTT 法檢測APS-CS NPs 納米粒濃度為10～50 μg·mL-1時細胞的活性，其吸光度如圖5 所示，當APS-CS NPs 納米粒濃度提高至50 μg·mL-1時，細胞增殖率仍保持在100%以上，呈增值狀態(tài)，APS-CS NPs 納米粒對細胞增殖率的影響無顯著性差異（P=0.557）。結果表明，當APS-CS NPs 納米粒濃度小于等于50 μg·mL-1時，具有良好的生物相容性，對H9c2 細胞無明顯細胞毒作用。

3 討論

為提高口服途徑APS 的吸收率，本實驗采用CS-NPs 作為納米載體，吸附APS 制備出APS-CS NPs 納米粒。首先通過檢測CS-NPs 納米粒徑考察了制備APS-CS NPs 納米粒最佳的CS 濃度和TPP濃度。CS 與TPP 的反應主要通過帶正電荷的氨基和帶負電荷磷酸基之間的靜電引力作用，因此不同濃度的CS 與TPP 在反應中所占基團的比例也不同，會影響納米粒子的形成及納米粒子的粒徑[7]。由表1 可見，當CS 濃度為1mg·mL-1、TPP 濃度為2mg·mL-1時，制備的CS-NPs 納米載體粒徑最小，為（67.4±3.16）nm，與以往的研究結果基本一致[8，9]。另外如若納米粒包載APS 的量太少起不到藥效，若APS 量太高則納米粒包載不了，因此，需進一步考察不同APS 濃度對包封率的影響。結果顯示，當APS 用量小于10 mg 時，包封率隨APS 用量增大急劇升高，CS 與TPP 離子凝膠化過程中對APS 的捕捉率也相應提高；而當用量繼續(xù)增大時，包封率又有所下降，這是因為此時體系中APS 的濃度已經足夠高，包封率的大小已經不受APS 加入量的限制，而是受到納米粒形成量的限制。本實驗中當APS 投藥量為10 mg 時可得到較高的包封率，即包封率為89.20%，與Vimal S 等[10]制備的DNA-CS-NPs 納米粒子（79.9%）均具有較高的包封率。

APS 作為配體，是否與CS-NPs 納米載體結合，需要對其結構進行表征。紅外吸收光譜主要反映化合物中官能團。對比APS、CS-NPs 納米載體和APSCS NPs 納米粒的紅外光譜發(fā)現，APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜與CS-NPs 納米載體的紅外光譜比較相似，而與APS 的紅外光譜存在明顯差異，這是因為盡管APS 已達到最大包封率，吸附在CS-NPs 納米載體上，但在APS-CS NPs 納米粒中仍以CS-NPs 為主。在APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜圖中，618.3 cm-1出現新的特征峰，說明APS 與CS-NPs 納米載體之間相互作用，APS-CS NPs 納米粒制備成功。

本實驗對制備的APS-CS NPs 納米粒進行理化特性表征。Zeta 電位通常用來表征納米顆粒的表面電荷性質，它還可以進一步用于探測帶電的活性分子是包裹在納米顆粒的中心還是表面[11]。APS 在蒸餾水中的Zeta 電位為-13 mV，CS-NPs 納米載體Zeta 電位為（41±0.82）mV[12]，APS-CS NPs 納米粒和CS-NPs 納米載體相同，Zeta 電位均為正，說明負的APS 分子是包埋在APS-CS NPs 納米粒的中心。納米粒子的Zeta 電位在±30 mV 以上被認為在懸浮狀態(tài)下是穩(wěn)定的[13]，因為粒子之間的電荷排斥足以抑制聚集和結合。本實驗制備的APS-CS NPs 納米粒Zeta 電位值在40 mV 左右，認為具有穩(wěn)定性。

最后測定不同濃度的APS-CS NPs 納米粒對H9c2 細胞株的生物相容性，結果表明，當APS-CS NPs 納米粒濃度小于等于50 μg·mL-1時，對H9c2細胞無明顯的細胞毒作用，且APS-CS NPs 納米粒濃度為50 μg·mL-1時，細胞增值率最高，因此，本實驗成功制備出APS-CS NPs 納米粒，該納米粒對細胞具有良好的相容性，可用于體內體外實驗研究。