張 博,陳立功,2，武 華，陰雅潔，孟利佳，郭康康，侯紹華，董世山,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心 河北 保定071001； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

新型鴨呼腸孤病毒病是由新型鴨呼腸孤病毒引起的一種急性傳染病，可感染番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨、綠頭野鴨和鵝等水禽［1-3］，發(fā)病鴨臨床表現(xiàn)為聚集扎堆、不愿進(jìn)食、腹瀉、部分雛鴨表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，外觀發(fā)病鴨眼周圍有明顯淚痕［4］；剖檢發(fā)病鴨常見肝臟明顯腫大，伴有不同程度的針尖狀壞死點(diǎn)，斑塊狀的瘀血、出血，壞死灶與周圍健康組織界限明顯［5］。近幾年NDRV 病已經(jīng)嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展［6］，目前預(yù)防本病的關(guān)鍵是做好養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理，改善鴨場飼養(yǎng)環(huán)境，保持良好的光照和通風(fēng)，做好防寒保溫工作，在該病的流行地區(qū)應(yīng)考慮接種疫苗［7］。

NDRV 屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，為分節(jié)段的雙股RNA 病毒，基因組長度大約 23 000 bp，G+C 含量大約為51.41%。NDRV 分為10 個(gè)RNA 片段，即3個(gè)大基因L1 ～L3，3個(gè)中基 因M1 ～M3；4 個(gè) 小 基 因S1 ～S4，除S1 基因片段外，L1 ～S4 所有基因片段均具有保守的末端序列，各編碼一種蛋白［8］。3 個(gè)大基因節(jié)段L1 ～L3，分 別 編 碼λA、λB 和λC3 種 蛋 白；3 個(gè)中基因節(jié)段M1 ～M3，分別編碼μA、μB 和μN(yùn)S 3 種蛋白；4 個(gè)小基因節(jié)段中的S1 基因片段為三順反子，編碼P10、P18 和σC 蛋白；S2、S3 和S4 分別編碼σA、σB 和σC 蛋白，但番鴨禽呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)的S4 片段是雙順反子基因，編碼P10 和σC 蛋白［9-10］。NDRV 的S3基因與MDRV 和禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV) 的S3 基因的分子特征有很大區(qū)別［11-12］，可以根據(jù)S3 基因差異性進(jìn)行分類。本研究參照GenBank 中的NDRV σB（登錄號為MK749405.1）基因序列設(shè)計(jì)1對特異性擴(kuò)增引物，建立了1 種TaqMan 熒光定量RT-PCR 檢測方法，可為NDRV 的檢測提供快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2019 年收集河北保定地區(qū)60 份疑似NDRV 感染病鴨組織（肝臟和脾臟），-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 毒株 NDRV、MDRV、ARV、鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)、鴨病毒性肝炎病毒（Duck viral hepatitis, DHV）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.3 主要試劑 Easypure Viral DNA/RNA Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試驗(yàn)試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司；普通質(zhì)粒小量提取試劑盒，購于天根生化科技有限公司；Fast TaqMan Mixture，均購自北京聚合美生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 臺式高速冷凍離心機(jī)，購自長沙易達(dá)儀器有限公司；PCR 儀，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；電泳儀，購自北京市六一儀器廠；自動(dòng)凝膠成像儀，購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；立式壓力蒸氣滅菌器，購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；熒光PCR 儀，購自美國BIO-RAD 生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NDRV σB 基因序列(MK749405.1)，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性上游引物5′-TCTATTCGCAGTGACCGTGC-3′， 下游引物5′-TCGATCATCTTCCAACCCGC-3′；探針 序列為5′-FAM-TTAGAGAGGCGAGGATACGAC- BHQ-3′，用于熒光定量PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為110 bp。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 根據(jù)試劑盒操作說明書進(jìn)行核酸提取、反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以其作為模板，用特異性上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（總體積為50 μL）：cDNA 模板4 μL，10 pmol/L 上 下 游 引 物 各2 μL，10×Prime STAR GXL Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，Primer STAR GXL DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 32 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后連接到pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，PCR 鑒定為陽性克隆后，提取質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成，進(jìn)行測序鑒定，并使用Nanodrop 2000 測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式:重組質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL) = (質(zhì)粒濃度 ×10-9×6.02×1023)/(660 道爾頓/ 堿基× 堿基數(shù))計(jì)算拷貝數(shù)，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 熒光定量PCR 條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按Fast TaqMan Mixture 試劑說明書推薦的20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR。以相同濃度陽性質(zhì)粒0.8 μL 為模板，采用矩陣法對引物濃度(0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μmol/L)和探針濃度(0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μmol/L)進(jìn)行優(yōu)化，再對退火溫度(55 ～60 ℃)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)設(shè)立陰性對照，獲得最佳反應(yīng)條件。將制備好的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為1.0×109拷貝/μL，然后進(jìn)行10 倍梯度稀釋至1.0×101拷貝/μL，用優(yōu)化好的TaqMan 熒光定量PCR 程序進(jìn)行擴(kuò)增。對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 提取MDRV、ARV、DTMUV、 DHV 的核酸，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后，按1.2.3 中的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行TaqMan 熒光定量PCR 擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)定NDRV 陽性質(zhì)粒為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，分析該方法的特異性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 取已知濃度的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍 倍 比 稀 釋，以1.0×107～1.0×101拷 貝/μL 等7 個(gè)梯度為模板，按1.2.3 中的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行TaqMan 熒光定量PCR 擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)空白對照，以檢測標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的最小拷貝數(shù)；同時(shí)與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋，取高、中、低（106、104、102拷貝/μL）3 個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用本試驗(yàn)建立的NDRV TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次；在不同時(shí)間段，取上述相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，每次間隔5 d，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到的Ct值來計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，評估該方法的重復(fù)性效果。

1.2.7 臨床樣品的檢測 從河北省地區(qū)采集的60 份臨床樣品，提取核酸后反轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為模板，利用本試驗(yàn)建立的NDRV TaqMan 熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR 方法檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDRV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

設(shè)計(jì)的特異性引物對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示目的條帶大約在110 bp（圖1），結(jié)果與預(yù)期片段大小相符，構(gòu)建的NDRVσB 全基因質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank 相應(yīng)序列對比完全一致，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒經(jīng)Nanodrop 2000測定濃度，通過公式換算得到重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為7.47×1010拷貝/μL。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of recombinant plasmid

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

優(yōu)化后的熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2×Fast TaqMan Mixture 10 μL；NDRV 上下游引物各0.8 μL（終濃度均為0.4 μmol/L），探針0.4 μL（終濃度均為0.2 μmol/L）；cDNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；退火/延伸59 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

由圖2 和圖3 可知，回歸方程式分別為NDRV：y=-3.354x+44.818 E=98.7%；R2均 大 于99.9%， 重組 質(zhì) 粒 標(biāo) 準(zhǔn) 品 在1.0×107～1.0×103拷 貝/μL 范圍時(shí)擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)Ct 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此可以根據(jù)檢測樣品的Ct 值，對樣品進(jìn)行定量 分析。

圖2 NDRV 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 NDRV fluorescence quantitative PCR standard curve

圖3 NDRV 熒光定量PCR 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curve of NDRV fluorescence quantitative PCR amplification

2.3 特異性試驗(yàn)

由圖4 可知，除陽性對照外，MDRV、ARV、DTMUV 和DHV 均呈陰性結(jié)果，表明本試驗(yàn)所建熒光定量PCR 檢測方法特異性強(qiáng)。

圖4 熒光定量PCR 的特異性檢測結(jié)果Fig.4 Specific detection results of fluorescence quantitative PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)

由圖5 可知，本試驗(yàn)所建的NDRVTaqMan 熒光定量PCR 方法最低檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 拷貝/μL，常規(guī)RT-PCR 檢測方法最低檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0×104拷貝/μL，表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)RT-PCR，敏感性高。

圖5 NDRV 熒光定量PCR 和常規(guī)PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 NDRV fluorescence quantitative PCR and conventional PCR sensitivity test results

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的熒光定量PCR 進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，組內(nèi)、組間的變異系數(shù)均小于2%（表1），表明該方法重復(fù)性較好。

表1 TaqMan 熒光定量RT-PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Repeatability test of TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

利用建立的熒光定量PCR 方法對60 份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出陽性樣品27 份，檢出率為45%，常規(guī)RT-PCR 方法檢出陽性樣品20 份，檢出率僅為33%。2 種方法檢測符合率為74.07%。說明本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法比常規(guī)RT-PCR 方法更適合NDRV 臨床的準(zhǔn)確檢測。

3 結(jié)論與討論

NDRV、MDRV 和ADV 都是禽正呼腸孤病毒，生物學(xué)特征表現(xiàn)基本相同，但是臨床和抗原性表現(xiàn)有很大不同［13］。NDRV 可感染各種鴨，這給該病的臨床診斷及防治帶來極大的困難。因而，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的快速檢測方法對準(zhǔn)確檢測NDRV 十分重要。目前，對于該病毒的診斷方法主要有病毒的分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)等方法［14-16］。熒光定量PCR 檢測靈敏度高于普通PCR，通常高于100 倍以上?，F(xiàn)階段檢測NDRV 多采用熒光染料法［17-18］，但熒光染料容易與引物發(fā)生非特異性結(jié)合，造成假陽性，大大降低檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。TaqMan 熒光定量PCR 方法，反應(yīng)體系中包含1 對引物和1 條探針，熒光探針的加入增加了反應(yīng)的準(zhǔn)確性并且此方法還有污染小、可以進(jìn)行多重試驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，即避免了假陽性問題，同時(shí)又可通過模板的Ct 值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)對起始模板進(jìn)行定量［19］。

本研究建立的NDRV TaqMan 熒光定量RTPCR 檢測方法，不但可以特異性檢測NDRV 還可以根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行NDRV 的定量檢測，并且還有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，該方法對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測濃度為10 拷貝/μL，是普通PCR 方法檢測敏感性的1 000 倍，和云濤建立的SYBR Green 熒光定量RT-PCR 方法的敏感性相同［16］，比韓宏宇等建立的熒光定量 RT-PCR 方法的敏感性高［20］?？蔀镹DRV 實(shí)驗(yàn)室診斷和早期流行病學(xué)調(diào)查的監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。