李曉天，任 達，高 衛(wèi)，孫素素，陳 來，劉東曉，張金林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，河北 保定 071001；2.河北省農(nóng)藥檢定監(jiān)測總站，河北 石家莊 050031）

植物病原菌引起的病害對農(nóng)作物的生產(chǎn)安全具有嚴重威脅，不僅會造成農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量損失，同時也影響其品質(zhì)［1］。殺菌劑的應(yīng)用是保障農(nóng)產(chǎn)品安全的重要手段，大大減少了農(nóng)事操作，提高了植物保護的效率［2-3］。然而過量和不合理地使用殺菌劑導致植物病原菌對其產(chǎn)生抗藥性［4-5］。例如，Gisi 等人報道了對三唑類、甲氧基丙烯酸酯類和琥珀酸脫氫酶類抑制劑耐藥的真菌菌株［6-8］。因此，創(chuàng)制“高效、低毒、安全”的綠色殺菌劑對于新型殺菌劑的研發(fā)具有重大意義［9-10］。

鄰苯二甲酰亞胺是一類重要的有機化合物，是農(nóng)藥、醫(yī)藥等化學合成步驟中的關(guān)鍵中間體［11-12］。N-取代的鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)也可作為農(nóng)藥中的活性基團，具有廣泛的生物活性，如除草、殺蟲和殺菌活性［13-15］。例如，它的代表性商業(yè)除草劑作為原卟啉氧化酶抑制劑［16-17］有丙炔氟草胺［18-19］、吲哚酮草酯［20］和氟胺草酯［21］等。此外，Martens 等人［22］報道了鄰苯二甲酰亞胺類衍生物可以用作殺菌劑。因此，以鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)為骨架的化合物的抗真菌活性值得進一步研究。

本研究設(shè)計合成了一系列鄰苯二甲酰亞胺類衍生物，并對其進行殺菌活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)新型的殺菌劑。同時通過對所得化合物進行單晶培養(yǎng)，得到化合物3a 的晶體結(jié)構(gòu)，從而進一步確定所得化合物的分子結(jié)構(gòu)。本研究采用生長速率法對所得化合物進行殺菌活性評價，以期得到具有優(yōu)良殺菌活性的化合物，為開發(fā)新型殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗過程中所用化學試劑為市售分析純或化學純。供試的9 種菌株分別是：番茄早疫病菌(Alternaria solani)； 黃 瓜 灰 霉 病 菌(Botrytis cinerea)；禾谷絲核病菌(Rhizoctonia cerealis)；茄子枯萎病菌(Fusarium oxysporum)；玉米穗腐病菌(Fusarium verticillioides)；瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)； 蘋 果 輪 紋 病 菌(Physalospora piricola)；小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。

1.2 合成方法

參照文獻［13］的方法，目標分子的反應(yīng)路線如圖1 所示。將化合物1（3.01 mmol）的乙酸（5 mL）溶液緩慢滴加至化合物2（3.31 mmol）的乙酸（10 mL）溶液中，攪拌至混合均勻，然后回流反應(yīng)4 h，待反應(yīng)完全，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到冰浴條件下攪拌0.5 h，待有固體析出，過濾去除濾液，濾餅經(jīng)硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚（沸點60 ～90℃）/乙酸乙酯（v∶v=3∶1），最終得到目標化合物。

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthesis route of the target compounds

1.3 單晶的培養(yǎng)和測定

為進一步驗證目標化合物的結(jié)構(gòu)，對其進行單晶培養(yǎng)。將化合物3a 溶于二氯甲烷/乙酸乙酯（v∶v=20∶1）的溶劑中，待緩慢蒸發(fā)，得到棒狀晶體結(jié)構(gòu)。通過Bruker SMART 1000 CCD 衍射儀，所測尺寸為0.20 mm×0.18 mm×0.12 mm，經(jīng)石墨單色化的 MoKα（λ=0.710 73 ?）射線，在113（2）K 下以φ-ω 掃描方式收集單晶衍射數(shù)據(jù)，其中6 105 個獨立衍射數(shù)據(jù)（Rint=0.038 9）用于解析晶體結(jié)構(gòu)，經(jīng)過Crystal Clear (Rigaku)進行數(shù)據(jù)的采集和處理。使用SHELXS-97 系統(tǒng)，采用直接方法和全矩陣最小二乘法分別進行結(jié)構(gòu)處理和數(shù)據(jù)改進［23-24］。

1.4 殺菌活性測定

稱取10 mg 目標化合物，加入100 μL DMF 溶解，配制成濃度為10×104mg/L 的母液。采用生長速率法［25］測定目標化合物的殺菌活性，將PDA 培養(yǎng)基融化后，冷卻至50 ℃左右，取5 μL 的待測藥液和10 mL PDA 培養(yǎng)基，加入到滅菌的培養(yǎng)皿中混勻得到50 mg/L 的帶藥培養(yǎng)基，靜置冷卻凝固后，用直徑為6 mm 的滅菌打孔器將活化的病原真菌制成菌餅，將菌餅倒置在培養(yǎng)基的中心位置，然后封口密封，倒置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時以不含藥劑的空白溶液為空白對照，以啶酰菌胺為陽性對照藥劑，每個處理重復3 次。根據(jù)空白對照的生長情況培養(yǎng)1 ～3 d 對其進行調(diào)查，按公式計算抑制率，采用Duncan's 新復極差法進行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標化合物結(jié)構(gòu)表征

本試驗共計合成8 個目標化合物（表1），其結(jié)構(gòu)表征如下：

化合物3a，白色固體，產(chǎn)率87%，m.p.: 153 ～ 154 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 ～7.99 (m, 1H), 7.97 ～7.81 (m, 2H), 7.46 ～7.37 (m, 1H), 7.30 (td, J = 8.1, 5.2 Hz, 1H), 7.26 ～7.15 (m, 1H), 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.63 (s), 164.59 (s), 156.89 (s), 154.43 (s), 144.39 (s), 136.11 (s), 135.25 (s), 134.10 (s), 131.93 (s), 127.76 (s), 125.01 (s), 123.03 (s), 122.32 (s), 118.40 (s), 61.42 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C15H9ClFNO3: 306.025 5, found:306.033 1。

化合物3b，黃色固體，產(chǎn)率30%，m.p.: 143 ～ 144 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (dd, J = 63.0, 3.8 Hz, 3H), 6.93 (s, 1H), 2.52 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.32 (s), 162.62 (s), 150.64 (s), 150.45 (s), 136.77 (s), 135.92 (s), 133.30 (s), 132.62 (s), 126.87 (s), 122.81 (s), 113.01 (s), 17.48 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C12H7ClN2O2S: 278.991 7, found: 278.998 8。

化合物3c，白色固體，產(chǎn)率78%，m.p.: 154 ～ 155 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89 (dd, J = 4.4, 3.9 Hz, 1H), 7.76 ～7.68 (m, 2H), 7.43 ～7.32 (m, 4H), 2.99 (s, 1H), 1.31 (d, J = 6.9 Hz, 6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.04 (s), 165.03 (s), 149.13 (s), 136.09 (s), 135.22 (s), 133.93 (s), 131.85 (s), 128.83 (s), 127.46 (s), 127.25 (s), 126.42 (s), 122.21 (s), 33.95 (s), 23.93(s). HRMS (ESI)［M+H］+calcd for C17H14ClNO2: 300.071 3, found: 300.079 1。

化合物3d，白色固體，產(chǎn)率58%，m.p.: 160 ～ 161 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.95 ～7.89 (m, 1H), 7.76 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 6.49 (s, 1H), 2.52 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.96 (s), 163.34 (s), 162.52 (s), 153.18 (s), 136.69 (s), 135.83 (s), 133.59 (s), 132.52 (s), 127.21 (s), 122.81 (s), 98.09 (s), 12.76 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C12H7ClN2O3: 263.014 5, found: 263.022 0。

化合物3e，白色固體，產(chǎn)率60%，m.p.: 195 ～ 196 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91 (dd, J = 4.6, 3.7 Hz, 1H), 7.81 ～7.74 (m, 2H), 7.60 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 164.65 (s), 163.59 (s), 138.84 (s), 136.69 (s), 135.83 (s), 133.61 (s), 132.52 (s), 129.13 (s), 127.39 (s), 122.76 (s), 104.67 (s), 36.51 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C12H8ClN3O2: 262.030 5, found: 262.037 9。

化合物3f，白色固體，產(chǎn)率71%，m.p.: 135 ～ 136 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (dd, J = 4.6, 3.6 Hz, 1H), 7.68 ～7.61 (m, 2H), 7.31 ～7.15 (m, 2H), 6.95 (dd, J = 5.1, 3.6 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.09 (s), 165.20 (s), 137.56 (s), 135.81 (s), 135.03 (s), 134.09 (s), 131.54 (s), 128.08 (s), 127.74 (s), 126.95 (s), 126.08 (s), 121.95 (s), 35.82 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C13H8ClFNO2S: 277.996 4, found: 278.003 8。

化合物3g，棕色固體，產(chǎn)率63%，m.p.: 231 ～ 232 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.42 (dd, J = 9.7, 2.1 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.95 (ddd, J = 26.6, 16.0, 7.9 Hz, 4H).13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.72 (s), 163.70 (s), 158.45 (s), 155.91 (s), 148.65 (s), 137.06 (s), 134.29 (s), 131.84 (s), 130.71 (s), 127.86 (s), 127.75 (s), 123.36 (s), 120.71 (s), 113.21 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C14H6ClFN2O4: 321.000 0, found: 321.005 9。

化 合 物3h， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率52%，m.p.: 178 ～179 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.93-7.82 (m, 1H), 7.70 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.02 (s), 165.01 (s), 151.35 (s), 136.08 (s), 135.21 (s), 133.94 (s), 131.84 (s), 128.59 (s), 127.47 (s), 126.18 (s), 126.04 (s), 122.21 (s), 34.76 (s), 31.32 (s). HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C18H16ClNO2: 314.087 0, found: 314.094 7。

表1 化合物3a ～3h 的化學結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of compounds 3a-3h

2.2 化合物3a 的晶體參數(shù)

全部非氫原子坐標通過多輪Fourier 合成確定，其原子坐標和各向異性溫度因子均采用全矩陣最小二乘法修正，最終的偏離因子為R=0.066 5, wR = 0.123 1 (w = 1/［σ2(Fo2) + (0.069 3P)2］,其中 P = (Fo2+ 2Fc2)/3)、S = 0.977，具體參數(shù)見表2。

表2 化合物3a 的晶體學數(shù)據(jù) Table 2 Crystallographic data of compound 3a

2.3 化合物3a 的單晶結(jié)構(gòu)分析

化合物3a 的晶體結(jié)構(gòu)和晶體堆積分別列于圖2 和 圖3。

圖2 通過X 射線衍射得到化合物3a 的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 2 Crystal structure of compound 3a by X-ray diffraction determination diffraction

圖3 化合物3a 的晶體堆積Fig. 3 Crystal packing of the compound 3a

化合物3a 的部分鍵長、鍵角和扭轉(zhuǎn)角如表3 所示。數(shù)據(jù)可在Cambridge Crystallographic Data Centre（https://www.ccdc.cam.ac.uk/）獲得（CCDC2004842）。雜環(huán)和苯環(huán)內(nèi)的鍵長和鍵角與文獻報道的值吻合較好［26］。由于鄰二聚體中鄰苯二甲酰亞胺與苯基環(huán)的π-π 共 軛，N(1)-C(9) (1.433(2) ?) 的 鍵 長 略短于正常的C-N (1.47 ?)。其中C(8)-N(1)-C(1), C(8)-N(1)-C(9) 和C(1)-N(1)-C(9) 的鍵角之和為359.36°，接近360°，表明N(1)原子具有sp2雜 交 狀 態(tài)。C(1)-N(1)-C(9)-C(10) 和C(8)-N(1)-C(9)-C(14)的扭轉(zhuǎn)角分別為-73.0°和 -63.4°，表明鄰苯二甲酰亞胺和苯環(huán)(C(9)-C(14))不在同一平面；C(1)-C(2)-C(3)-C(4) 和C(5)-C(6)-C(7)-C(8)的扭轉(zhuǎn)角分別為-174.37°和176.51°，因此吡咯烷酮與苯環(huán)(C(2)-C(7)) 不在同一平面上；C(11)-C(12)-C(13)-F(1) 和F(1)-C(13)-C(14)-C(9) 的 扭轉(zhuǎn)角分別為-177.64°和177.26°，因此，氟原子F(1) 和苯環(huán)(C(9)-C(14)) 不在同一平面上；C(1)-N(1)-C(8)-O(2) 和C(2)-C(7)-C(8)-O(2) 的 扭 轉(zhuǎn) 角分別為178.43°和-177.7°，表明鄰苯二甲胺和C(7)-C(8)-O(2)處的羰基部分不在同一平面。此外，化合物3a 的晶體結(jié)構(gòu)中還存在C-H···O 分子間氫鍵 （圖3），從而穩(wěn)定了晶體結(jié)構(gòu)。

表3 化合物3a 的部分鍵長、鍵角和扭轉(zhuǎn)角Table 3 Selected bond lengths (?),bond angles (°) and torsion angles (°) for the compound 3a

續(xù)表:

2.4 化合物的殺菌活性測定

根據(jù)表4 可以得知，在50 mg/L 濃度下，化合物3a、3b、3c、3e、3f 和3g 對小麥赤霉病菌的抑 制 率 分 別 為36%、38%、27%、28%、37% 和26%，顯著優(yōu)于對照藥劑啶酰菌胺；化合物3g 和3h 對禾谷絲核病菌的抑制率均為36%，與對照藥劑啶酰菌胺的活性相當；化合物3a、3d 和3e 對禾谷絲核病菌的抑制率分別為43%、39% 和55%，顯著優(yōu)于對照藥劑啶酰菌胺。化合物對其他供試菌株表現(xiàn)出一般的殺菌活性。綜上所述，化合物3e對禾谷絲核病菌表現(xiàn)出中等的殺菌活性，值得進一步研究。

表4 目標化合物3a ～3h 的殺菌活性（50 mg/L，生長速率法，抑制率/%）Table 4 In vitro fungicidal activity of compounds 3a-3h（50 mg/L, growth rate method, inhibition rate /%）

3 討論與結(jié)論

鄰苯二甲酰亞胺類衍生物具有廣泛的生物活性，常作為農(nóng)藥合成中重要的中間體，進而其骨架結(jié)構(gòu)在農(nóng)藥創(chuàng)制中發(fā)揮了重要作用［27-28］。本研究以3-氯苯酐為主要起始原料，與苯胺類、噻唑、噁唑、吡唑、噻吩、呋喃等雜環(huán)胺類，經(jīng)過一步親核取代反應(yīng)，以30%～87%的收率得到系列鄰苯二甲酰亞胺類衍生物，在冰乙酸為溶劑，反應(yīng)溫度為 110 ℃的條件下有利于產(chǎn)率提高［29］。當噻唑胺為親核試劑時，可能因為噻唑雜環(huán)的影響，使胺的親核性減弱，導致產(chǎn)率僅為30%。合成的所有化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H NMR,13C NMR, HRMS 表征，其中化合物3a 的結(jié)構(gòu)經(jīng)過X-射線衍射解析，進一步驗證了鄰苯二甲酰亞胺類結(jié)構(gòu)。

文獻報道了鄰苯二甲酰亞胺類衍生物具有除草和殺蟲活性［13-14］。但其殺菌活性鮮有報道，本試驗選取9 種供試菌株進行殺菌活性篩選。結(jié)果顯示，當取代基Ar 為吡唑時，即化合物3e 對禾谷絲核病菌的抑制效果要優(yōu)于Ar 為噻唑即化合物3b；同時化合物3e 對禾谷絲核病菌的活性優(yōu)于Ar 為其他取代基化合物。當Ar 為五元雜環(huán)時，本試驗合成的化合物對小麥赤霉病菌和禾谷絲核病菌的抑制活性優(yōu)于其他苯環(huán)取代的化合物。當Ar 分別為4-異丙基苯環(huán)和4-叔丁基苯環(huán)時，即化合物3c 和3h 對所測試菌株的抑制活性無明顯差異，由此推測Ar 苯環(huán)取代基的空間大小與抑菌活性無明顯關(guān)系。綜上可得，化合物3e 的殺菌活性值得進一步開發(fā)研究。