王麗麗,李克梅,王金銘,努爾斯曼姑麗艾海提,田呈明

(1.北京林業(yè)大學(xué)/省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100083;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊830052)

柳樹是重要的用材和造林綠化樹種,作為快速生長的木本主要生物質(zhì)來源,在生態(tài)修復(fù)、裝飾材料、纖維生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛。新疆柳樹資源豐富,約有50種(變種)分布于高山、平原、河岸、沙丘、極地等多種生境,甚至有些種是耐旱、寒以及鹽堿等抗逆性強(qiáng)的種類[1]。

柳樹葉銹病發(fā)生于葉部,是一類危害柳樹健康生長的重要生物災(zāi)害之一。柳樹整株染病后,會(huì)在正常秋葉脫落前六周或更長的時(shí)間內(nèi)大量提前落葉,易導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱而誘發(fā)其他病蟲害,尤其是對(duì)苗期及幼樹危害更大,降低成活率[1],造成經(jīng)濟(jì)損失。

柳樹葉銹病病原種類較多,均屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、銹菌目(Pucciniales)、柵銹菌科(Melampsoraceae)、柵銹菌屬(MelampsoraCast)。柵銹菌大都屬于專性寄生,與寄主關(guān)系密切,除少數(shù)種同主寄生于大戟科(Euphorbiaceae)、亞麻科(Linaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、夾竹桃科(Apocynaceae)和金絲桃科(Hypericaceae)外,多數(shù)柵銹菌種為轉(zhuǎn)主寄生,即夏孢子和冬孢子階段生于楊柳科(Salicaceae),而性孢子和銹孢子階段寄生于冷杉屬(Abies)、蔥屬(Allium)、衛(wèi)矛屬(Euonymus)、落葉松屬(Larix)、紅門蘭屬(Orchis)、茶藨子屬(Ribes)、虎耳草屬(Saxifraga)、堇菜屬(Viola)等植物上[1-2]。

迄今為止,國內(nèi)外已報(bào)道柵銹菌屬內(nèi)有效種約100種,其中,超過50種寄生于楊柳科植物,而寄生于該科內(nèi)柳屬(Salix)的柵銹菌數(shù)量最多,約40余種,國內(nèi)34種[2-10]。在新疆,經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)研究報(bào)道了4種柳屬柵銹菌[8]。近十年,Zhao等[6-7]采用DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)、大亞基(LSU)等的分子系統(tǒng)發(fā)育研究與形態(tài)學(xué)相結(jié)合,對(duì)國內(nèi)柳屬柵銹菌進(jìn)行深入研究,并報(bào)道來自新疆柳屬的柵銹菌新種、國內(nèi)新記錄種和新疆新記錄種各1種。筆者在2020年報(bào)道新種和新疆新記錄種各1種[9]。在傳統(tǒng)柵銹菌分類中以冬孢子形態(tài)、夏孢子形態(tài)、寄主與轉(zhuǎn)主寄主種類作為主要鑒定依據(jù),然而,冬孢子有時(shí)在種間差異不明顯,有時(shí)甚至不產(chǎn)生,反而是夏孢子產(chǎn)生并存活時(shí)間最長。目前,許多國內(nèi)外學(xué)者研究柵銹菌分類發(fā)現(xiàn),夏孢子形狀、表面刺突、側(cè)絲特征在種間具有明顯差異,常被用于分種的主要依據(jù),促使柵銹菌分類體系得到進(jìn)一步補(bǔ)充完善。

筆者近幾年在新疆各地廣泛采集銹菌標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn),本地區(qū)柳樹葉銹病普遍發(fā)生,其病原柵銹菌種類、寄主范圍、分布地點(diǎn)都較以往有所不同。本文利用現(xiàn)代真菌分類學(xué)技術(shù),對(duì)新疆柳屬葉銹病柵銹菌物種、寄主及分布開展研究,為新疆菌物分類及多樣性研究提供標(biāo)本和基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為林木病害診斷與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2012—2016年,于新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰、塔城、伊犁、烏魯木齊、昌吉、阿克蘇、庫爾勒、和田等地州,山地、平原、牧場(chǎng)、河岸、荒漠、農(nóng)田及城市綠化地等生境采集柳屬葉銹病標(biāo)本,標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物標(biāo)本室(HMAAC)。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 利用實(shí)體顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)柵銹菌夏孢子及冬孢子階段的形態(tài)特征進(jìn)行拍照、測(cè)量及描述,顯微鏡檢以乳酚油作浮載劑[10]。夏孢子階段特征觀察:夏孢子堆葉面著生位置,夏孢子形態(tài)、大小、壁厚度、表面是否具有光滑區(qū)、刺間距、芽孔的數(shù)量及位置,側(cè)絲形狀、大小、壁厚度、著生位置。冬孢子階段特征觀察:冬孢子堆葉面著生位置,冬孢子著生位置,冬孢子形狀、大小、壁厚度。

1.2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 DNA提取主要參考玻片研磨法[11];選用ITS和LSU兩個(gè)基因片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,二者擴(kuò)增引物為ITS1F和ITS4、NL1和NL4[12]。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),于4℃保存。從最新文獻(xiàn)和GenBank中篩選已知柳屬柵銹菌和外群落葉松楊柵銹菌(M.laricis-populina)的基因序列,利用RaxmlGUI1.3軟件的最大似然法(ML)和MrBayes v.3.1.2軟件的貝葉斯分析(BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 種類鑒定及檢索表

經(jīng)對(duì)45份柳屬柵銹菌標(biāo)本進(jìn)行主要形態(tài)特征研究(圖1、表1),共鑒定出9種柵銹菌,其中,米黃柳柵銹菌(M.asalicis-michelsonii)為國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)的種,在菌名前標(biāo)識(shí)##符號(hào),表示為新種;為新疆首次發(fā)現(xiàn)的有3種,扁桃柵銹菌(M.amygdalinae)、云南柳柵銹菌(M.salicis-cavaleriei)和中國黃花柳柵銹菌(M.salicis-sinicae),標(biāo)識(shí)#符號(hào),表示為新疆銹菌新記錄種。其余5種均為新疆已知種,北極柵銹菌(M.arctica)、伊朗柵銹菌(M.iranica)、松柳柵銹菌(M.larici-epitea)、白柳柵銹菌(M.salicis-albae)、銀柳柵銹菌(M.salicis-argyraceae)。寄主范圍共涉及柳屬內(nèi)14種,其中,藍(lán)葉柳(S.capusii)等8種在國內(nèi)外報(bào)道的柳屬柵銹菌寄主范圍內(nèi)屬首次出現(xiàn),其名稱前標(biāo)識(shí)*符號(hào),表示為該銹菌的寄主新記錄(表2)。

表1 新疆柳屬葉銹柵銹菌的夏、冬孢子堆階段形態(tài)特征Table1 Uredinia and telia morphological characteristics of Melampsora species on Salix in Xinjiang

表2 新疆柳屬葉銹柵銹菌的寄主范圍及分布Table2 Hosts and distribution of Melam psora species on Salix in Xinjiang

本文對(duì)9種新疆柳樹柵銹菌制定平行式形態(tài)分類檢索表,以供相關(guān)病原種類鑒定研究參考。檢索表如下。

1.夏孢子通常為長橢圓形至卵形 …………2

1.夏孢子通常為球形、卵形至寬橢圓形…4

2.夏孢子堆僅葉正面生…………………………………………#M.salicis-cavaleriei

2.夏孢子堆葉背面生或葉兩面生 …………3

3.單主寄生,夏孢子堆葉背面生,極少葉正面生……………………………#M.amygdalinae

3.轉(zhuǎn)主寄生,夏孢子堆葉兩面生,葉背面生為主………………………………M.salicis-albae

4.冬孢子角質(zhì)層下生或表皮層及角質(zhì)層下生,夏孢子堆葉背面生 ……#M.salicis-sinicae

4.冬孢子表皮層下生 ………………………5

5.夏孢子堆葉兩面生 ………………………6

5.夏孢子堆葉背面生 ………………………8

6.夏孢子堆葉正面生為主 ……M.iranica

6.夏孢子堆葉背面生為主 …………………7

7.冬孢子堆葉兩面生,葉正面生為主…………………………##M.salicis-michelsonii

7.冬孢子堆葉兩面生,葉背面生為主……………………………………………M.arctica

8.冬孢子頂端不增厚 ……M.larici-epitea

8.冬孢子頂端增厚…………………………………………………M.salicis-argyraceae

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

本次系統(tǒng)發(fā)育研究獲得ITS和LSU序列長度約分別為560 bp和570 bp,經(jīng)構(gòu)建ML和貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹,二者相對(duì)應(yīng)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及分析結(jié)果一致(圖2)。M.amygdalinae(支持率98/0.96)、M.iranica(79/0.85)、M.larici-epitea(88/0.93)、M.salicis-albae(99/1)和M.salicis-argyraceae(88/0.98)分別與相應(yīng)已知種具有較密切的親緣關(guān)系而聚于同一分支,這5種柵銹菌的形態(tài)學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果具有一致性,充分說明ITS和LSU序列信息在其種間具有明顯差異。

但在系統(tǒng)發(fā)育樹頂端M.arctica、M.salicissinicae和M.abietis-caprearum卻匯聚在一起,就形態(tài)特征而言,它們都具有形態(tài)極為相似的夏孢子,即個(gè)體均較小,為球形或?qū)挋E圓形,這可能是三者在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一類群的主要原因。但M.arctica夏孢子堆可葉兩面生,以葉背面生為主,而M.salicis-sinicae和M.abietis-caprearum夏孢子堆僅在葉背面生。此外,M.arctica冬孢子大小為55～60×17～24μm,頂端未增厚[2-3],M.salicis-sinicae冬孢子為39～86×10～26μm,較長而窄,頂端增厚[4],而M.abietis-caprearum冬孢子偏狹小為19～30×9～12 μm,頂端不增厚[2],特此區(qū)分為3個(gè)種。由此說明ITS和LSU基因信息在這3種之間的種間差異過小無法區(qū)分,需通過結(jié)合形態(tài)學(xué)差異來區(qū)別。此外,在系統(tǒng)發(fā)育樹中,M.salicis-cavaleriei和M.salicis-michelsonii均未與任何已知種匯合,而是分別形成的獨(dú)立分支,說明二者均為獨(dú)立的種,結(jié)合比較形態(tài)特征的差異,后者已作為新種被發(fā)表[9]。前者的相關(guān)報(bào)道極少,唯一模式標(biāo)本因難以提取DNA至今僅有形態(tài)描述[10,23],但依據(jù)文獻(xiàn),M.salicis-cavaleriei是所有已知柳屬柵銹菌中唯一夏孢子堆僅葉正面生的物種。本研究中該標(biāo)本的夏孢子堆恰是僅葉正面著生,此外,夏孢子、側(cè)絲和冬孢子的形態(tài)均與該已知種形態(tài)描述一致,特此鑒定為本種。

3 討論與結(jié)論

3.1 新疆柳屬葉銹病柵銹菌物種組成

本研究從14種柳屬植物葉部共發(fā)現(xiàn)9種柵銹菌,包括1個(gè)新種M.salicis-michelsonii和3個(gè)新疆新記錄種M.amygdalinae、M.saliciscavaleriei和M.salicis-sinicae,M.salicis-argyraceae等5種新疆已知種。其中,M.salicis-cavaleriei、M.salicis-sinicae、M.salicis-michelsonii和M.salicis-argyraceae均只分布于中國,為中國特有種,且后二者在國內(nèi)僅分布于新疆,又為新疆特有種[4,7,9-10]。

M.amygdalinae是柳屬上唯一報(bào)道的單主寄生柵銹菌[2],本研究采集該種標(biāo)本時(shí)僅形成夏孢子階段,因此,已結(jié)束的性孢子和銹孢子以及還未形成的冬孢子階段均未能見到。M.saliciscavaleriei為中國云南特有種,本次研究發(fā)現(xiàn)該種在新疆也有分布,經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究后,首次報(bào)道了該種的ITS和LSU片段核酸信息。

據(jù)新疆柳屬葉銹病柵銹菌以往的報(bào)道,還有個(gè)別種在本次研究中未發(fā)現(xiàn),如M.capraearum、M.epitea和M.ribesii-viminalis[10],原因在 于本次標(biāo)本采集地還不足夠廣泛,在今后的研究工作中,還有待于擴(kuò)大調(diào)查繼續(xù)補(bǔ)充。至此,新疆柳屬葉銹病柵銹菌的種類共有12種,充分體現(xiàn)新疆銹菌物種具有豐富的多樣性。

3.2 新疆柳屬葉銹病柵銹菌寄主范圍特點(diǎn)

在寄主植物種類及數(shù)量方面,文獻(xiàn)報(bào)道M.arctica和M.larici-epitea廣泛分布國內(nèi)外,其寄主范圍較廣。在本研究中,二者侵染柳樹種類較多,分別為4種、各占本次寄主種類總數(shù)的29%,亦體現(xiàn)其寄主范圍較廣。2014年報(bào)道的新種M.salicis-sinicae相關(guān)文獻(xiàn)少,在本次研究中可侵染5種不同柳樹,占比達(dá)到36%,體現(xiàn)該種寄主范圍較廣。M.salicis-albae為世界廣布種,但從文獻(xiàn)與本研究結(jié)果(標(biāo)本數(shù)量10份)發(fā)現(xiàn),該種只侵染S.alba一種寄主,寄主范圍單一說明該菌專性寄生性較強(qiáng)。其次,寄主S.argyracea(9份)和(8份)均可被3種不同柵銹菌侵染,二者和S.alba的標(biāo)本數(shù)量共占標(biāo)本總數(shù)的60%,是最易被柵銹菌侵染的柳屬樹種。此外,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),有8種柳屬植物新增為銹菌寄主新記錄,大大擴(kuò)增了柵銹菌寄主范圍。本文因缺少柵銹菌性孢子器和銹孢子器寄生的標(biāo)本,未能對(duì)其轉(zhuǎn)主寄主進(jìn)行相關(guān)研究,還有待日后完善,僅在文中提供文獻(xiàn)記載的相關(guān)信息以供參考(表3)。

表3 新疆柳屬葉銹柵銹菌的性、銹孢子器階段形態(tài)特征Table3 Spermogonia and aecia morphological characteristics of Melampsora species on leave of Salix

3.3 新疆柳屬葉銹病柵銹菌地理分布特點(diǎn)

就地理分布及生境而言,本研究柳屬柵銹菌在山地、平原、牧場(chǎng)、河岸、荒漠、農(nóng)田及城市綠化地等多個(gè)生境均有不同分布。其中,分布于沙漠的物種最少,僅M.salicis-michelsonii(1份)為典型荒漠真菌;分布于山地物種最多,M.salicissinicae(14份)、M.salicis-argyraceae(4份)、M.iranica(2份)和M.salicis-cavaleriei(2份)分布于天山,M.amygdalinae(1份)分布于阿爾泰山,共5種23份標(biāo)本合占本次研究總柵銹菌物種數(shù)和標(biāo)本數(shù)的一半,可見山地是其優(yōu)勢(shì)分布生境。

本文只是柳屬葉銹病柵銹菌一階段性報(bào)道,科研工作者還需要更多、更深入的野外調(diào)查以及采用更先進(jìn)的分類技術(shù)去探索新疆菌物多樣性,相信還有許多未知物種或類群有待被發(fā)現(xiàn)。

致 謝:承蒙新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草環(huán)學(xué)院周桂玲教授和林園學(xué)院王兵副教授在寄主植物鑒定方面給予的幫助,在此表示誠摯的感謝!