王 琪,趙維薇,陳雪玲,吳 麗,鄧 茹,周書來,*

(1.宜賓職業(yè)技術(shù)學院五糧液技術(shù)學院,四川宜賓 644003;2.大理大學公共衛(wèi)生學院,云南大理 671000;3.樂山市食品藥品檢驗檢測中心,四川樂山 614000;4.樂山職業(yè)技術(shù)學院藥學系,四川樂山 614000)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是一種具有滋陰補腎、清熱解毒的名優(yōu)藥材[1]。其藥用部分主要為莖,而其他部分的利用相對較少,因此造成了一定的資源浪費[2]。目前,已有學者對鐵皮石斛花開展了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)其富含石斛堿、黃酮、多糖、花色苷和氨基酸(以精氨酸為主)等多種功能性成分[3-5],并且具有抗氧化、滋陰護肝、提高男性精子活力等保健功效[6-8]。目前對鐵皮石斛花的綜合利用還停留在初加工層面,如將鐵皮石斛花風干后制作風味花茶、凍糕或以其提取物加工成飲片、含片等[9-12]。故亟需要對鐵皮石斛花進行深入研究,以提高其附加值。

速溶茶粉是一種方便快捷的固體飲料[13],能夠滿足消費者對方便、營養(yǎng)、健康的需求。因而,將鐵皮石斛花制作成速溶茶粉便是一種能提高其附加值的有效途徑。楊劉艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)浸提工藝是制作速溶茶粉的關(guān)鍵步驟,其不僅對速溶茶粉的感官有較大影響,而且還對產(chǎn)品的得率有一定影響。前期試驗也表明,若將鐵皮石斛花按照速溶茶粉的傳統(tǒng)工藝進行加工制作,會出現(xiàn)粉末粘壁較為嚴重、不易成粉的現(xiàn)象。以兩種或兩種以上原料按一定的比例組合制成復合速溶茶,不僅在功效上能進行疊加,而且在感官特性方面更是有明顯的改善[15]。因此,采用噴霧干燥時成粉效果好、回收率高且具有一定功效的綠茶提取物與鐵皮石斛花進行復配制作速溶茶粉,以解決鐵皮石斛花提取物難以噴霧干燥且口感不佳的問題[16]。

本研究在采用響應面法優(yōu)化鐵皮石斛花浸提工藝的基礎上,與綠茶提取物進行不同比例復配,以期制成感官特性優(yōu)良的功能性復合速溶茶粉,并檢測其功能性成分與含量,以及抗氧化活性,為鐵皮石斛花的進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛花 湖北洲和生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;綠茶提取物 無錫太陽綠寶科技有限公司;兒茶素(C)、沒食子酸(GA)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、鞣花酸(EA)、1,4,6-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(GG)、咖啡堿(CA)、楊梅素(My)、槲皮素(Qu)、木犀草素(Lu)、山奈酚(Kf)、花旗松素(Tax)等物質(zhì)的標準品 成都曼思特生物科技有限公司;丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)等氨基酸標準品 美國安捷倫公司;食品級無水乙醇(95%vol) 山東檉碩化工有限公司;鄰苯三酚 國藥化學試劑公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) 美國Sigma-Aldrich公司;維生素C 成都市科龍化工試劑廠;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司;RE-5003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長征儀器制造有限公司;KQ-100KDB型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;TPG-100型噴霧干燥機 江蘇先鋒干燥工程有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計 杭州俊升科學器材有限公司;1200型高速液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合速溶茶粉的制備工藝

操作要點:將鐵皮石斛花中的雜質(zhì)及異形物去除,50 ℃烘干,粉碎后過60目篩;將鐵皮石斛花粉加入圓底燒瓶中,再加入不同濃度的乙醇溶液,使用超聲波清洗機輔助浸提后備用;浸提物經(jīng)快速定性濾紙過濾后取濾液在40 ℃的條件下減壓濃縮,濃縮液(固形物含量為22.3%)與綠茶提取物按照不同比例在160 ℃下噴霧干燥,得到復合速溶茶粉。

1.2.2 浸提條件單因素優(yōu)化試驗 在料液比、乙醇濃度、超聲溫度及超聲時間分別為1∶25 (g∶mL)、60%、40 ℃、40 min的基礎條件下,保持其它因素不變,只改變其中一個因素,設置料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g∶mL)、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、超聲溫度(30、35、40、45、50 ℃)、超聲時間(20、30、40、50、60 min),以鐵皮石斛花的浸提率為指標,每組試驗重復3次進行單因素試驗。

1.2.3 浸提條件響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎上,以料液比(A)、乙醇濃度(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D),進行響應面試驗,因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平

1.2.4 浸提率的測定 鐵皮石斛花浸提率的測定按照下式進行:

浸提率(%)=浸提過濾后乙醇溶液的質(zhì)量(g)/鐵皮石斛花與浸提前乙醇溶液的總質(zhì)量(g)×100

1.2.5 復合速溶茶粉感官審評方法 將鐵皮石斛花浸提濃縮液和綠茶提取物分別按1∶1、1∶0.75、1∶0.5、1∶0.25 (g∶g)的比例進行復配,160 ℃噴霧干燥,得到復合速溶茶粉。感官審評由11名(5男6女)品茶員組成的感官評定小組參照國家標準《茶制品 第1部分:固態(tài)速溶茶》[17]進行復合速溶茶感官審評,感官審評標準如表2所示。

表2 復合速溶茶粉感官評審標準

1.2.6 復合速溶茶粉功能性物質(zhì)測定 應用高效液相色譜法(HPLC)檢測樣品中各功能性成分,并根據(jù)峰面積使用外標法進行定量分析。氨基酸組分的洗脫梯度程序在王富花等[18]的基礎上改進為:0～5 min,B液從22%增加至25%;5～30 min,B液從25%增加至100%;30～32 min,B液100%保持不變;32～33 min,B液由100%降低至22%后停止。C、EC、EGC、ECG、EGCG、GA、GG、CA、GC、CG、GCG11種物質(zhì)的洗脫梯度程序在褚廣翠等[19]的基礎上調(diào)整為:0～21 min,B液從10%增加至20%;21～22 min,B液從20%增加至100%;22～26 min,B液100%保持不變;26～27 min,B液由100%線性梯度降低至10%后停止。Lu、EA、My、Qu、Kf、Tax 6種物質(zhì)的洗脫梯度程序在孫麗芳等[20]的基礎上改善為:0～0.5 min,B液從10%增加至45%;0.5～10 min,B液從45%增加至50%;10～18 min,B液從50%增加至100%;18～21 min,B液100%保持不變;21～22 min,B液從100%降低至10%后停止。

1.2.7 復合速溶茶粉抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH·清除作用的測定 采用分光光度法[21],分別配制質(zhì)量濃度為0.0313、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000 mg/mL的復合速溶茶粉溶液,隨后用95%的乙醇配制濃度為0.2 mg/mL的DPPH溶液,將不同濃度的復合速溶茶粉溶液分別與DPPH溶液等體積置于具塞試管中,搖勻,避光反應30 min后,在517 nm波長處測定其吸光度,并以維生素C作為陽性對照。通過下式計算DPPH自由基清除率:

式中:A0為DPPH溶液加乙醇的吸光度;A1為DPPH溶液加復合速溶茶粉溶液的吸光度;A2為復合速溶茶粉溶液加乙醇的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個試驗重復3次,結(jié)果取平均值。采用Origin Pro 12.1軟件進行數(shù)據(jù)制圖,應用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析,利用Design Expert 10.1軟件進行響應面設計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對浸提率的影響 由圖1可知,鐵皮石斛花的浸提率隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,當料液比為1∶30 (g∶mL)時,鐵皮石斛花的浸提率達到了最高的49.68%±1.56%。由于料液比的增加會使鐵皮石斛花細胞壁內(nèi)外的濃度差變大,使得鐵皮石斛花細胞內(nèi)的有效成分更加容易滲出,進而鐵皮石斛花的浸提率顯著提高(P<0.05)。但當料液比為1∶35 (g∶mL)時,其浸提率反而較1∶30 (g∶mL)時降低,主要原因是乙醇在浸提過程中會吸收超聲波的能量,致使鐵皮石斛花細胞壁破裂不完全,造成浸提率降低[2]。因此,選擇料液比為1∶25～1∶35 (g∶mL)用于響應面試驗。

圖1 料液比對浸提率的影響

2.1.2 乙醇濃度對浸提率的影響 由圖2可知,當乙醇濃度由40%增加到70%時,鐵皮石斛花的浸提率隨之升高。當乙醇濃度為70%時,鐵皮石斛花的浸提率最高為54.33%±1.72%。因乙醇濃度的增加會增加鐵皮石斛花細胞壁內(nèi)外的濃度差,有利于乙醇對鐵皮石斛花細胞內(nèi)物質(zhì)的提取,進而促進浸提率顯著提高(P<0.05)。當過高的乙醇濃度會使親水性物質(zhì)不易溶解在乙醇溶液中[22],故當乙醇濃度從70%時繼續(xù)升高后,鐵皮石斛花的浸提率反而有所下降。因此選用乙醇濃度為60%、70%、80%用于后續(xù)響應面法試驗。

圖2 乙醇濃度對浸提率的影響

2.1.3 超聲溫度對浸提率的影響 由圖3知,鐵皮石斛花的浸提率隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,超聲溫度40 ℃是浸提鐵皮石斛花的最適溫度,其浸提率達到最高的54.33%±1.72%。當超聲溫度低于40 ℃時,不利于鐵皮石斛花細胞內(nèi)物質(zhì)的浸出,進而造成浸提率顯著低于54.33%(P<0.05);當超聲溫度高于40 ℃時,鐵皮石斛花細胞內(nèi)含物易被分解,也會出現(xiàn)浸提率下降的現(xiàn)象[24]。故選擇超聲溫度為35～45 ℃進行響應面試驗。

圖3 超聲溫度對浸提率的影響

2.1.4 超聲時間對浸提率的影響 由圖4可知,鐵皮石斛花的浸提率隨著超聲時間的增加而增加,當超聲時間為60 min時,鐵皮石斛花的浸提率最高為58.95%±1.67%。超聲時間的延長有利于鐵皮石斛花內(nèi)含物質(zhì)的浸出,但當超聲時間超過一定范圍時,鐵皮石斛花的浸提率不再顯著增加。例如當超聲時間從50 min增加到60 min時,其浸提率不再顯著增加(P>0.05)。故超聲時間40～60 min用于后續(xù)響應面試驗。

圖4 超聲時間對浸提率的影響

2.2 響應面法試驗

通過Box-Behnken中心組合設計[24]對料液比(A)、乙醇濃度(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)4個因素進行響應面試驗,結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設計及結(jié)果

對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果如表4。以浸提率為響應值,經(jīng)回歸擬合后,得到相應的回歸方程:

表4 浸提率的方差分析

浸提率(%)=60.13-0.57A+0.17B-0.13C-0.06D-0.95AB-1.19AC+0.31AD-1.88BC-0.29BD+1.19CD-0.14A2-1.92B2-0.69C2-0.89D2

四個因素的兩兩相互作用的響應面圖如圖5所示。由圖5知,四個因素的兩兩相互作用中,因素B與因素C所形成的響應曲面坡度最為陡峭,與方差分析中交互項BC對鐵皮石斛花浸提率的影響極為顯著(P<0.01)的結(jié)論相吻合;響應曲面坡度陡峭程度其次為因素A與因素C以及因素C與因素D所形成的響應曲面,再次為因素A與因素B所形成的響應曲面,這與方差分析中交互項AB、AC、CD對鐵皮石斛花浸提率的影響顯著(P<0.05)的結(jié)論也吻合;因素A與因素D以及因素B與因素D所形成的響應曲面坡度較為平坦,故交互項AD、BD對鐵皮石斛花浸提率的影響不顯著(P>0.05)。

圖5 各因素交互作用對浸提率影響的響應面圖

根據(jù)響應面軟件分析,鐵皮石斛花在料液比1∶25 (g∶mL)、乙醇濃度67.63%、超聲溫度45 ℃和超聲時間54.97 min的條件下,浸提率可獲得最高的理論值62.22%。為了試驗的可操作性將軟件得出的最優(yōu)浸提條件進行適當調(diào)整為料液比1∶25 (g∶mL)、乙醇濃度68%、超聲溫度45 ℃和超聲時間55 min,進行三組平行試驗后,得到的浸提率為62.07%±0.95%,與通過軟件獲得的理論值相比偏差不大(其相對誤差為0.24%),證明該結(jié)果合理可靠[24]。

2.3 不同原料復配比例對復合速溶茶粉感官特性的影響

將鐵皮石斛花浸提物與綠茶提取物按照1∶0.25、1∶0.5、1∶0.75和1∶1 (g∶g)復配,加工成速溶粉后進行感官審評,結(jié)果如表5所示。由表5知,綠茶提取物加入后可以顯著改善速溶茶粉的感官特性,當鐵皮石斛花浸提物與綠茶提取物比例為1∶1 (g∶g)時,復合速溶茶粉的感官特性良好,感官評分為93分,因此確定復合速溶茶粉中鐵皮石斛花浸提物與綠茶提取物復配比例為1∶1 (g∶g)。

表5 復合速溶茶粉感官審評

2.4 復合速溶茶粉功能性成分分析

經(jīng)過最優(yōu)工藝條件得到的復合速溶茶粉,測定其各類氨基酸含量及兒茶素、鞣花酸與咖啡堿等功能性成分及其含量,結(jié)果如圖6與圖7所示。

圖6 三種樣品中氨基酸的含量

圖7 三種樣品中其他功能性物質(zhì)含量

由圖6知,在復合速溶茶粉、鐵皮石斛花浸提物和綠茶提取物中均檢測到16種氨基酸,其中包括Ile、Leu、Phe、Thr、Val5種必需氨基酸和Arg、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Phe、Tyr8種藥效氨基酸。復合速溶茶粉中氨基酸總量達(70.89±7.33) mg/g,高于鐵皮石斛花浸提物(10.31±0.61) mg/g與綠茶提取物(36.38±4.01) mg/g;而且復合速溶茶粉中每一種氨基酸的含量均顯著高于鐵皮石斛花浸提物和綠茶提取物(P<0.05)。

由圖7知,在復合速溶茶粉和綠茶提取物中均檢測到17種功能性物質(zhì),而在鐵皮石斛花浸提物中只檢測到槲皮素、花旗松素、山奈酚、楊梅素和鞣花酸5種功能性物質(zhì)。故復合速溶茶粉中的17種功能性物質(zhì)主要是由綠茶提取物提供的,使速溶茶粉不僅具有鐵皮石斛花的相關(guān)功效,而且具備綠茶的保健功能。復合速溶茶粉中槲皮素、花旗松素、山奈酚的含量分別為:9.23、1.27、6.22 mg/g,均顯著高于鐵皮石斛花浸提物和綠茶提取物(P<0.05);楊梅素(2.01 mg/g)和鞣花酸(8.64 mg/g)的含量也顯著高于鐵皮石斛花浸提物(P<0.05)。研究表明,上述5種物質(zhì)均具有重要的生物活性,如槲皮素具有改善機體脂肪代謝、抑制甘油三酯積累的功能[25];花旗松素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激等生理功能[26];山奈酚主要用于心血管疾病等的治療與預防[27];楊梅素能改善由免疫應答引起的炎癥反應[28];鞣花酸對預防人類骨肉瘤具有一定的作用[29]。綜上,此復合速溶茶粉具有較好的營養(yǎng)及保健價值。

2.5 復合速溶茶粉抗氧化活性測定結(jié)果

2.5.1 復合速溶茶粉對DPPH·清除作用測定結(jié)果 由圖8知,在濃度小于0.5000 mg/mL時,復合速溶茶粉對DPPH·清除率隨其濃度的增加而升高,但其清除率低于維生素C的陽性對照;復合速溶茶粉的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.0934 mg/mL高于維生素C的IC50(0.0127 mg/mL)。當濃度達到0.5000 mg/mL后,復合速溶茶粉對DPPH·清除率穩(wěn)定在96.49%±0.37%,表明復合速溶茶粉中的功能性成分對DPPH·具有較強的清除作用。

圖8 維生素C及復合速溶茶粉對DPPH·的清除作用

圖9 維生素C及復合速溶茶粉對的清除作用

3 結(jié)論