沈千匯,黃 琦,李文佳,錢正明,3,*,張 霽,,*

(1.華南師范大學,腦科學與康復醫(yī)學研究院,廣東廣州 510631;2.廣東東陽光藥業(yè)有限公司國家中醫(yī)藥管理局重點研究室,廣東東莞 523850;3.湘南學院,湖南郴州423000)

羊肚菌為羊肚菌科羊肚菌(Morchella)的子實體,是世界著名珍稀食藥用真菌,早在明代李時珍的《本草綱目》中就有記載,羊肚菌具有化痰利氣、益腸胃、補腦提神等功效[1-2]。現代藥學研究表明,羊肚菌含氨基酸、維生素、礦物質、多糖和脂肪酸等多類成分,具有抗氧化、抗腫瘤及保肝保腎等藥理活性[3-5]。

目前羊肚菌化學質量評價研究主要在多糖方面,其他類成分研究較少[6-8]。中藥材成分復雜,以某單一成分作為質量評價指標無法全面反映藥材的質量。中藥指紋圖譜是一種綜合有效的中藥質量評價方法,其中最常用的為液相指紋圖譜分析技術,其已廣泛應用于冬蟲夏草[9]、牛樟芝[10]、靈芝[11]等珍稀真菌類中藥材的質量評價[12]。傳統(tǒng)中藥液相指紋圖譜分析常用甲醇作為樣品提取溶劑,采用甲醇-水或乙腈-水作為液相洗脫溶劑,因此在樣品制備和分析過程中都會使用到大量有害有機溶劑[13-15]。如何減少有害有機溶劑在中藥分析中的使用是現代分析方法研究的重要研究方向。Xu等[16]采用離子液體作為提取溶劑,提取青檸果實中黃酮苷類化合物,有效縮短了實驗操作時間,同時減少了有機試劑的用量。付春梅等[17]采用乙醇代替甲醇、乙腈作為流動相,采用HPLC定量分析了黃芩、葛根等5種中藥的有效成分,減少了有害溶劑使用。因此開發(fā)一種綠色的提取方法和液相分析方法對羊肚菌的質量評價提升具有重要的意義。

本實驗在參考現有研究的基礎上[16,18-19],采用離子液體-水溶液作為提取溶劑,采用乙醇-水作為液相洗脫溶劑,建立了一種綠色環(huán)保的高效液相色譜分析方法,并對珍稀食藥用真菌羊肚菌進行了指紋圖譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌 共20批,其中含14批六妹羊肚菌,6批不同食藥用菌,所有實驗樣品經廣東東陽光藥業(yè)有限公司國家中醫(yī)藥管理局重點研究室錢正明高級工程師鑒定為指定品種,具體樣品信息見表1;1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([BMIM]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([BMIM]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]PF6)、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIM]PF6) 純度99%,上海成捷化學有限公司;對照品:胞苷(純度99.00%,批號:#L1504068) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尿嘧啶(純度99.60%,批號:100469-201302) 中國食品藥品檢定研究院;尿苷(純度98.00%,批號:6213) 上海詩丹德生物技術有限公司;鳥苷(純度93.60%,批號:111977-201501) 中國食品藥品檢定研究院;腺苷(純度99.40%,批號:WRS-18001) 武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司;乙醇 色譜純,美國賽默飛世爾科技公司;乙酸 LC-MS級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

表1 試驗樣品來源

1260型高效液相色譜儀、反相色譜柱Agilent ZORBAX SB-AQ C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 美國安捷倫科技有限公司;XS205型十萬分之一電子天平 美國梅特勒-托利多儀器有限公司;5425型離心機 德國艾本德中國有限公司;Tube Mill 100 control研磨機 艾卡(廣州)儀器設備有限公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng) 德國默克密理博公司;2020型高通量組織研磨機 科瑞恩特北京科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 依次精密稱取尿嘧啶、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷對照品20.35、19.99、19.84、20.11、19.98 mg,置于20 mL容量瓶中,加超純水溶解并定容至刻度線(20 mL),稀釋50倍制成濃度分別為20.35、19.99、19.84、20.11、19.98 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備 取供試品適量,經研磨機粉碎過三號篩制備成供試品粉末,取供試品粉末100 mg,精密稱定,置2 mL離心管中,分別稱入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIM]PF6)400 mg和超純水600 mg,并將研磨珠置于該離心管中,濕法研磨提取10 min,離心(12000 r/min)5 min,取上清液,經100 ℃水浴5 min,再離心(12000 r/min)5 min,取上清液過0.45 μm水系濾膜,取續(xù)濾液,即得。

1.2.3 色譜條件 核苷類化合物極性大,在反相色譜中多采用高比例水流動相進行分析[18,20]。本實驗采用耐純水洗脫的Agilent ZORBAX SB-AQ C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)作為分離色譜柱,0.2%乙酸(A)-乙醇(B)流動相進行梯度洗脫(0～4 min,0% B;4～15 min,0～30% B);柱溫40 ℃;流速1.0 mL/min;檢測波長260 nm;進樣量2 μL。

1.2.4 提取條件的優(yōu)化 前期離子液體提取優(yōu)化文獻常用單因素考察的方法對離子液體提取過程中的關鍵因素進行優(yōu)化,如離子液體類型、離子液體碳鏈長度、離子液體濃度、提取時間和料液比[16,18,21]。故本實驗也采用單因素對上述5種提取參數進行了考察,同時采用外標一點法計算5種核苷成分總提取量,比較各參數對羊肚菌中化學成分提取效率的影響,每個樣品做兩次平行實驗,提取量(Xi)通過公式(1)進行計算:

式(1)

式中:Xi代表提取量(μg/mg),Ai代表目標峰峰面積,Ar代表對照品峰面積,Cr代表對照品濃度(μg/mL),V代表樣品體積(mL),m代表樣品稱樣量(mg)。

1.2.4.1 離子液體離子類型考察 本實驗選用脂溶性([BMIM]BF4、[BMIM]PF6)和水溶性([BMIM]Cl、[BMIM]Br)兩類離子液體考察[18]。比較不同離子液體類型對提取量的影響,分別采用質量分數20%的[BMIM]Cl、[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[BMIM]PF6溶液為提取溶劑,固定料液比1∶20 (mg/mg),其他條件按“1.2.2供試品溶液制備”項提取,隨后按“1.2.3色譜條件”進行分析,比較各類型離子液體的提取效率。

1.2.4.2 離子液體碳鏈長度考察 考察離子液體不同碳鏈長度對提取量的影響,分別采用質量分數20%的[BMIM]PF6、[OMIM]PF6溶液為提取溶劑,固定料液比1∶20 (mg/mg),其他條件按“1.2.2供試品溶液制備”項提取,隨后按“1.2.3色譜條件”進行比較分析。

1.2.4.3 不同質量分數離子液體考察 考察不同質量分數離子液體對提取量的影響,分別配制質量分數為10%、20%、30%、40%、50%的[OMIM]PF6溶液,固定料液比1∶20 (mg/mg),加入上述不同質量分數的離子液體,其他條件按“1.2.2供試品溶液制備”項提取,隨后按“1.2.3色譜條件”進行分析,比較不同離子液體的質量分數對提取的影響。

1.2.4.4 提取時間考察 考察提取時間對提取量的影響,以質量分數為40%的[OMIM]PF6溶液為提取劑,料液比1∶20 (mg/mg),使用高通量組織研磨機濕法研磨分別提取5、10、15、20、25 min,其他條件按“1.2.2供試品溶液制備”項提取并按“1.2.3色譜條件”進行分析,考察提取時間對提取的影響。

1.2.4.5 料液比考察 考察料液比對提取量的影響,以質量分數為40%的[OMIM]PF6溶液為提取劑,采用高通量組織研磨機濕法研磨提取10 min,料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (mg/mg),其他條件按“1.2.2供試品溶液制備”項提取,按“1.2.3色譜條件”進行比較分析。

1.2.5 方法學考察 指紋圖譜分析方法通常會進行精密度、重復性和穩(wěn)定性的方法學測試[22-23]。本研究的精密度試驗:取混合對照品溶液,重復進樣6針,記錄各對照品峰面積。重復性試驗:稱取同一六妹羊肚菌樣品6份進行色譜分析,記錄6份樣品中各共有峰峰面積。穩(wěn)定性試驗:稱取六妹羊肚菌供試品溶液,4 ℃存放,在24 h內進樣10次,記錄各共有峰峰面積。

1.2.6 指紋圖譜的建立 取20批試驗樣品按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,并按“1.2.3”項下色譜條件分析,得到20批樣品的液相色譜圖。將其中14批六妹羊肚菌樣品的色譜數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版),設S1為參照圖譜,采用多點校正后進行自動匹配,標記10個共有峰,生成六妹羊肚菌對照指紋圖譜(R),用對照指紋圖譜(R)對14批六妹羊肚菌、6批食藥用菌進行相似度評價。

1.3 數據處理

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)對樣品色譜數據進行相似度評價,并計算各樣品的相對峰面積,然后應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對試驗樣品色譜數據進行聚類分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

圖1 離子液體離子類型考察

圖2 離子液體的碳鏈長度考察

2.1.3 不同質量分數離子液體考察 確定提取溶劑為[OMIM]PF6,進一步比較離子液體-水溶液中所含的不同離子液體的量(質量分數為10%、20%、30%、40%、50%)對提取量的影響,結果如圖3顯示,總提取量隨著溶劑中離子液體的量增加而增加,質量分數為40%時呈現峰值,繼續(xù)升高質量分數，總提取量反而降低，可能因離子液體的粘度大,其擴散能力隨著含量的增加而降低,羊肚菌中化學成分難以提出,故選擇40%離子液體-水溶液用于實驗樣品分析。

圖3 離子液體質量分數考察

2.1.4 提取時間考察 比較不同提取時間(5、10、15、20、25 min)對提取量的影響,結果如圖4,研磨時間為10 min時提取量最大,隨著提取時間的繼續(xù)延長,提取成分可能被破壞,影響目標成分的檢測,故選用研磨時間為10 min。

圖4 提取時間的考察

2.1.5 料液比考察 以質量分數為40%的[OMIM]PF6溶液為提取劑,濕法研磨提取10 min,不同料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (mg/mg))提取結果如圖5所示,料液比為1∶10時提取量達峰值,已經提取完全,隨后料液比逐漸增大時,可能受離子液體的粘度影響,提取量反而減少,故選取最適料液比為1∶10。

圖5 料液比的考察

2.2 方法學考察

本實驗從精密度、重復性、穩(wěn)定性三方面對新建立的色譜分析方法進行了方法學確認。精密度試驗各對照品色譜峰峰面積RSD%均在1%以內,表明儀器精密度良好。重復性試驗各共有峰的峰面積的RSD%均小于4.0%,表明該方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗各共有峰的峰面積的RSD%均在4.0%以內,表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 共有峰的指認 根據各樣品HPLC色譜圖確定了10個共有峰,通過與混合對照品溶液色譜圖的比對(見圖6),確認其中的1號色譜峰為胞苷,5號色譜峰為尿嘧啶,7號色譜峰為尿苷,9號色譜峰為鳥苷,10號峰為腺苷。

圖6 混合對照品與羊肚菌樣品HPLC色譜圖

2.3.2 參照峰的選擇 因10號峰出峰時間居中,峰面積適中,分離度好,在各樣品中均穩(wěn)定存在,故選取10號峰為參照峰S(見圖6)。

2.3.3 指紋圖譜相似度評價 使用生成的對照指紋圖譜(R)對14批六妹羊肚菌、6批食藥用菌進行相似度評價,分析結果見圖7和表2。結果顯示,14批六妹羊肚菌樣品的相似度均在0.9以上,有6批食藥用菌樣品相似度在0.25～0.65之間。

表2 20批試驗樣品的相似度評價結果

圖7 20批試驗樣品HPLC-DAD指紋圖譜

2.4 聚類分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的組間連接法,以夾角余弦作為度量標準,以各樣品10個共有峰的相對峰面積(表3)為變量進行聚類分析,結果見圖8。20批試驗樣品可分為2大類,第一類為S1～S14號樣品,均為六妹羊肚菌樣品,樣品間差異較小;第二類為S15～S20號樣品,均為不同的食藥用菌,與羊肚菌比較差異較大,說明實驗建立的方法可有效區(qū)分羊肚菌與其他常見食藥用菌。

表3 20批試驗樣品共有峰的相對峰面積

圖8 20批試驗樣品的聚類分析結果

2.5 主成分分析

以各樣品共有峰的相對峰面積(表3)為變量,采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析,結果見表4和圖9。由表4可知,前3個成分累計方差貢獻率達89.411%,表明這3個成分反映了原始變量的大部分信息,因此以其為主成分進行分析,結果見圖9。由圖9可知,20批樣品可分為3類,第1類為S1～S14,均為羊肚菌,各樣品間差異較小;第2類為S17和S20,其余樣品歸為第3類,第2、3類均為其他食藥用菌,與羊肚菌樣品比較差異較大,該結果與相似度評價、聚類分析結果基本一致,說明該實驗方法可有效區(qū)分羊肚菌與其他常見食藥用菌。

表4 主成分分析特征值以及貢獻率

圖9 20批試驗樣品主成分分析結果

3 討論與結論

羊肚菌化學成分前期研究多以乙腈、甲醇作為流動相[29-31]。文獻調研發(fā)現,乙醇-水作為流動相體系在合適的柱溫和流動相比例條件下,分析結果同甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)的分析結果基本一致,差異不顯著[17,31-34]。前期研究表明乙醇可替代甲醇、乙腈作為流動相達到綠色分析要求,故本實驗選用綠色溶劑——乙醇作為流動相,比較了3種流動相體系(水-乙醇、0.1%甲酸-乙醇、0.2%乙酸-乙醇)對羊肚菌成分的分離效果,結果顯示,0.2%乙酸-乙醇體系分離效果較好,色譜峰出峰較多,該體系在快速分析檢測(分析時間<15 min)的同時,還減少了有機試劑對環(huán)境的污染。此外,在該實驗色譜條件下比較了不同檢測波長(220、260、280、350 nm)的分離效果,結果顯示,檢測波長為220、280和350 nm下時存在基線不穩(wěn)定、色譜峰缺失等現象,檢測波長為260 nm時,色譜峰分離較好且基線穩(wěn)定,色譜峰出峰較多,故選擇260 nm作為檢測波長。

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對20批試驗樣品(含14批六妹羊肚菌、6批不同食藥用菌)進行相似度評價,結果顯示,與羊肚菌參照圖譜(R)比較,14批羊肚菌樣品相似度系數均大于0.9,其他樣品相似度系數在0.25～0.65間,與羊肚菌樣品存在明顯差異,同高效液相分析結果基本一致。同時聚類分析和主成分分析結果顯示,14批不同產地的羊肚菌樣品差異較小,說明在不同的生長環(huán)境和儲存條件中,其化學成分質量均一穩(wěn)定;此外,各分析結果表明羊肚菌與其他食藥用菌化學成分存在顯著差異,說明建立的方法可用于羊肚菌與相似食藥用菌的鑒別。

綜上,本實驗建立了一種快速、高效、綠色的羊肚菌高效液相指紋圖譜分析方法,為羊肚菌及其相關產品綜合質量評價的提升提供了技術支撐,為其深入化學研究和開發(fā)應用提供了數據參考。