張克龍，郝鵬飛，巫介棚，朱羿龍，許 汪，韓繼成，哈 卓，杜壽文，花群義，曹琛福，鄭 敏，羅廷榮，金寧一，李 昌

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所省部共建吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122；3. 深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫中心，廣東 深圳 518045；4. 廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病防治中心，廣西 南寧 530001)

藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)是呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬成員。其傳播主要借助節(jié)肢動(dòng)物如庫(kù)蠓、沙蠅等[1]。藍(lán)舌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必報(bào)的動(dòng)物傳染性疫病，我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病。藍(lán)舌病的重大危害主要體現(xiàn)在：對(duì)綿羊和山羊的致死率高，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，人力物力消耗巨大。至2019年，BTV已有27種血清型，中國(guó)至少有7種BTV血清型，但主要流行血清型為BTV-1型和16型[2]。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用痘苗病毒載體成功構(gòu)建和表達(dá)了許多病毒抗原基因，如HIV[3]等，已驗(yàn)證痘苗病毒載體的穩(wěn)定性與安全性。藍(lán)舌病病毒VP2作為藍(lán)舌病病毒衣殼蛋白，在病毒吸附過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是決定血清型的特異性抗原。該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體以保護(hù)動(dòng)物，是藍(lán)舌病新型基因工程疫苗研究的首選抗原。

痘苗病毒天壇株(Vaccinia virus Tian Tan,VTT)可以有效刺激機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，常常用作疫苗的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)了一種痘苗病毒穿梭載體(pSTKE)，可以攜帶外源基因插入至痘苗病毒的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因處，使該基因失活。TK基因不是痘苗病毒復(fù)制的必須基因，但TK基因的缺失會(huì)減弱痘苗病毒的復(fù)制能力，使痘苗病毒適用于作為疫苗遞送載體。

目前商用疫苗包括減毒疫苗和滅活苗，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)使用痘苗病毒載體進(jìn)行藍(lán)舌病16型重組疫苗的研究，因此本研究擬利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的痘苗病毒載體pSTKE，構(gòu)建出1株能夠穩(wěn)定表達(dá)16型BTV VP2蛋白并且具備良好的免疫原性和安全性的重組痘苗病毒疫苗(rVTT-VP2)，以期為防控16型藍(lán)舌病提供安全有效的疫苗。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒和細(xì)胞株 含有BTV-16VP2基因的質(zhì)粒由深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫中心花群義研究員惠贈(zèng)。感受態(tài)Trans-T1和載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。痘苗病毒穿梭載體pSTKE、痘苗病毒天壇株(VTT株)和BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶XbaI、SalI，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素，均購(gòu)自Gibco公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；2×TaqPCR預(yù)混試劑，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 目標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)及穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 為構(gòu)建痘苗病毒穿梭質(zhì)粒，利用NCBI設(shè)計(jì)BTV-16VP2引物，上游添加酶切位點(diǎn)XbaⅠ及Kozak序列，下游添加酶切位點(diǎn)SalⅠ。引物序列為BTV-16VP2-F：5′-ATCTAGAGCCACCATGGCTGCTCAGAA-3′；BTV-16VP2-R：5′-GTCGACTTTTGCTAGCCTACACAGTCGGCGCA-3′；TK-F：5′-GGACGCGTATTGATTCACACCGTATTACAG-3′；TK-R：5′-CGCCCGGGTTCTCCTAATAAGTTACACCGT-TTG-3′。以含有BTV-16VP2的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出目的片段，將其連接至載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Trans-T1，挑取單克隆菌落，小量提取質(zhì)粒，得到pEASY-VP2。使用核酸內(nèi)切酶XbaⅠ、SalⅠ 37 ℃雙酶切質(zhì)粒pEasy-VP2，將VP2連接到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pSTKE中，轉(zhuǎn)化到Trans-T1，挑取單克隆菌落和小量提取質(zhì)粒后得到pSTKE-VP2。

1.4 痘苗病毒的重組、篩選及純化 于6孔板中每孔接種2×106個(gè)BHK細(xì)胞，感染5 MOI 的VTT，37 ℃、5% CO2感染2 h，再用pSTKE-VP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感染了VTT的BHK細(xì)胞。48 h后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，低速離心后獲取上清，得到rVTT-VP2。

將上述上清接入BHK-21細(xì)胞，48 h后挑取綠色熒光噬斑，反復(fù)凍融后再次接入BHK細(xì)胞，重復(fù)以上操作，直至噬斑處均為綠色熒光病變細(xì)胞，獲得高純度的rVTT-VP2。

1.5 重組痘苗病毒的PCR和RT-PCR鑒定 擴(kuò)增rVTT-VP2病毒，48 h后收取病變細(xì)胞，并提取基因組DNA和RNA。用1.2引物，擴(kuò)增VP2和痘苗非必須TK基因。

1.6 重組痘苗病毒遺傳穩(wěn)定性分析 將rVTT-VP2在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)傳代20次，取1、5、10、15、20代病變細(xì)胞，并提取基因組DNA，用PCR方法檢測(cè)rVTT-VP2的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定 利用1.2所示引物BTV-16VP2-F和BTV-16VP2-R，以含有BTVVP2基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可成功獲得2 706 bp的片段(圖略)，送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，目的基因與理論序列一致。

使用XbaⅠ、SalⅠ雙酶切pSTKE-VP2可成功切出2 706 bp的目的片段和4 527 bp的載體片段，如圖1，與預(yù)期結(jié)果一致，證明穿梭質(zhì)粒pSTKE-VP2構(gòu)建成功。

圖1 穿梭質(zhì)粒pSTKE-VP2酶切鑒定Fig.1 Digestion identification of shuttle plasmid pSTKE-VP2M:λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker; 1:質(zhì)粒pSTKE-VP2 XbaⅠ/SalⅠ; 2:質(zhì)粒 pSTKE-VP2M：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：Plasmid pSTKE-VP2 XbaⅠ/SalⅠ； 2：Plasmid pSTKE-VP2

2.2 痘苗病毒的重組、篩選及純化 將pSTKE-VP2轉(zhuǎn)染至感染了VTT的BHK-21細(xì)胞后，用噬斑純化法篩選重組病毒rVTT-VP2，直至噬斑處均為綠色熒光病變細(xì)胞(見(jiàn)中插彩版圖2)。

圖2 重組痘苗病毒的篩選 (200×)Fig.2 Screening of recombinant vaccinia virus (200×)A、B：空白對(duì)照； C、D：共轉(zhuǎn)染； E、F：第1代重組痘苗病毒篩選； G、H：第5代重組痘苗病毒篩選； I、J：第10代重組痘苗病毒篩選A、B：Mock； C、D：Co-transfection； E、F：Screening of 1st recombinant vaccinia virus； G、H：Screening of 5th recombinant vaccinia virus； I、J：Screening of 10th recombinant vaccinia virus

2.3 重組痘苗病毒PCR和RT-PCR鑒定 提取篩選成功的重組病毒rVTT-VP2的基因組DNA和RNA，使用1.2引物分別擴(kuò)增BTV-VP2基因、TK基因，進(jìn)行基因組整合與轉(zhuǎn)錄的鑒定。結(jié)果如圖3所示，重組痘苗病毒基因組DNA和cDNA擴(kuò)增出BTV-16VP2片段，未擴(kuò)增出VTTTK基因特異性條帶，證明已成功篩選出rVTT-VP2。

圖3 重組痘苗病毒的PCR和RT-PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant vaccinia virus by PCR and RT-PCRM：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：rVTT-VP2 gDNA； 2：rVTT-VP2 cDNA； 3、4：陰性對(duì)照；5：VTT TK； 6：TK陽(yáng)性對(duì)照； 7：rVTT-VP2 gDNA；8：rVTT-VP2 cDNAM：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：rVTT-VP2 gDNA；2：rVTT-VP2 cDNA； 3、4：Negative control； 5：VTT TK；6：TK positive control； 7：rVTT-VP2 gDNA；8：rVTT-VP2 cDNA

2.4 遺傳穩(wěn)定性分析 將篩選成功的rVTT-VP2連續(xù)傳20代，利用1.2的引物擴(kuò)增其基因組，對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，1、5、10、15、20重組痘苗病毒rVTT-VP2均能擴(kuò)增出2 706 bp的目的片段，表明重組痘苗病毒rVTT-VP2傳代20次內(nèi)具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 重組痘苗病毒rVTT-VP2遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of recombinant vaccinia virus rVTT-VP2M：Wide range DNA Marker； 1～5:rVTT-VP2第1代、第5代、第10代、第15代、第20代； 6：陰性對(duì)照； 7：陽(yáng)性對(duì)照M:Wide range DNA Marker; 1～5:1st,5th,10th,15th,20th generation of rVTT-VP2; 6:Negative control; 7:Positive control

3 討論

藍(lán)舌病病毒有27個(gè)血清型，眾多血清型缺乏交叉保護(hù)[4]。BTVL2基因編碼的VP2是BTV的主要衣殼蛋白，位于無(wú)囊膜BTV的最外層，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起到重要作用。其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性血清型抗體，中和藍(lán)舌病病毒。VP2的失活將導(dǎo)致藍(lán)舌病病毒失去血凝活性[5]。就目前而言，國(guó)內(nèi)疫苗的研究進(jìn)展主要在以下幾個(gè)方面：藍(lán)舌病1型滅活苗[6]、禽痘病毒載體疫苗、馬皰疹病毒載體、VLP、藍(lán)舌病16型腺病毒載體表達(dá)等；藍(lán)舌病3、4、5、8、15、12、16、25型單抗的制備[7-9]。但尚沒(méi)有進(jìn)行16型痘苗病毒重組藍(lán)舌病疫苗的研究。

痘苗病毒載體是當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的新型疫苗載體，痘苗病毒宿主范圍廣，研究背景較為清楚，安全高效，基因組龐大，插入較為巨大的外源基因片段的同時(shí)仍然具有感染的能力。為此，我們進(jìn)行了表達(dá)16型藍(lán)舌病病毒VP2基因的重組痘苗病毒的構(gòu)建。構(gòu)建時(shí)，在VP2基因前添加了Kozak序列，以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)；而且突變了VP2基因中3個(gè)痘苗病毒終止信號(hào)序列(TTTTNT)可免受其他外源基因轉(zhuǎn)錄的干擾。PCR組病毒從基因水平進(jìn)行鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的rVTT-VP2遺傳穩(wěn)定性良好，能穩(wěn)定表達(dá)藍(lán)舌病衣殼蛋白VP2，rVTT-VP2可在BHK-21細(xì)胞上大量穩(wěn)定表達(dá)，為后續(xù)免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。