張 寒,孔垂民,劉宗柱,劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是動物腸道中的常在菌[1]，當(dāng)受到應(yīng)激因素影響或腸道微生物區(qū)系紊亂時，便會大量繁殖引起腸道鼓氣癥狀，并產(chǎn)生毒素作用于腸黏膜上皮細(xì)胞從而引起腸黏膜脫落，通常被認(rèn)為是引起壞死性腸炎的主要病原菌[2-6]。隨著飼料中藥物添加劑的禁用，肉雞的壞死性腸炎愈加普遍，每年給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的損失超過了60億美元[7]。所以加強對該病的研究具有重要的經(jīng)濟意義。本試驗對規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場送檢的臨床腸炎癥狀的肉雞腸道樣品進(jìn)行了產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定、藥敏試驗及同源性分析，為肉雞梭菌性腸炎的深入認(rèn)識及預(yù)防控制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 山東部分地區(qū)肉雞養(yǎng)殖場送檢的臨床癥狀為腹瀉、拉肉樣便或過料的日齡不等肉雞的腸道樣品53份。

1.1.2 實驗動物 成年昆明系小鼠，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.1.3 試劑 所用培養(yǎng)基、生化反應(yīng)管，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR試劑，購自北京擎科生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌計數(shù) 取回腸內(nèi)容物1 g，用生理鹽水進(jìn)行10倍倍比稀釋到106倍，取各稀釋度稀釋液按傾注平板法操作進(jìn)行活菌計數(shù)[8]，42 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.3 細(xì)菌的生化試驗 牛乳爆烈發(fā)酵試驗：挑取純化菌落，接種于裝有含鐵牛乳培養(yǎng)基的試管中。42 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

微量發(fā)酵生化管鑒定：挑取純化好的菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖、棉子糖、蛋白胨和明膠生化管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。

1.2.4 細(xì)菌毒素的多重PCR鑒定 挑取分離純化好的單菌落，利用煮沸法提取細(xì)菌的DNA作為模板，參照田冬青[9]針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β、ε、τ四種毒素基因的特異性引物進(jìn)行多重PCR擴增，根據(jù)多重PCR擴增的電泳結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型。

1.2.5 動物試驗 取患病肉雞腸道分離株單菌落接種FT培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)8 h后，按1%比例接種皰肉培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)10 h后進(jìn)行離心，分別取菌液離心上清液和皰肉培養(yǎng)基稀釋菌體沉淀調(diào)整濃度為109CFU/mL的菌液腹腔注射小鼠各5只，每只200 μL，同時設(shè)注射等體積的皰肉培養(yǎng)基作為攻毒對照組。每組隔離飼養(yǎng)觀察72 h，記錄小鼠發(fā)病和死亡情況。

1.2.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥敏試驗 選取分離的43株雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌利用紙片擴散法進(jìn)行藥敏試驗。選取苯唑西林、青霉素G、紅霉素、大觀霉素、萬古霉素、克林霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、新霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、卡那霉素15種藥物進(jìn)行藥敏試驗，根據(jù)《歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判定。

1.2.7 產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rRNA基因序列擴增及進(jìn)化樹分析 選取13株自不同宿主和不同地區(qū)分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌與1株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株利用16S rRNA基因的通用引物27 F和1492 R進(jìn)行PCR擴增[10]。將與預(yù)期片段大小一致的PCR擴增產(chǎn)物送往上海派森諾生物股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對。對14株不同來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rRNA基因序列利用MEGA7.0進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落及菌體形態(tài)的觀察 菌株在TSC培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h后，菌落中間呈黑色，周圍出現(xiàn)乳白色渾濁圈(見中插彩版圖1A)。在綿羊血平板上形成灰白色、邊緣整齊的大菌落，并產(chǎn)生雙重溶血(見中插彩版圖1B)。顯微鏡油鏡下可見革蘭陽性的兩端鈍圓的粗大桿菌(見中插彩版圖1C)。

圖1 菌落及菌體形態(tài)觀察結(jié)果Fig.1 Results of colony and bacteria morphologyA:細(xì)菌在TSC平板的菌落形態(tài)； B:細(xì)菌在血平板的菌落形態(tài)； C:細(xì)菌鏡檢結(jié)果 (1 000×)A:Morphology of bacterial colony on TSC; B:Morphology of bacterial colony on blood plate; C:Microscopic results of bacterial staining (1 000×)

2.2 菌落計數(shù)結(jié)果 傾注平板法顯示所檢測的腸道內(nèi)容物活菌數(shù)量均在106CFU/g以上，而健康雞腸道內(nèi)容物的活菌數(shù)量為102～103CFU/g。

2.3 細(xì)菌的生化鑒定 牛乳爆烈發(fā)酵試驗結(jié)果表明：細(xì)菌在含鐵牛乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，由于發(fā)酵牛乳中的乳糖并產(chǎn)生大量氣體使牛乳凝固成海綿狀(圖2)。

圖2 牛乳爆烈發(fā)酵試驗Fig.2 Milk burst fermentation test1～4: 接種臨床分離株； 5: 接種標(biāo)準(zhǔn)株； 6: 陰性對照1～4: Inoculation of clinical isolates;5: Inoculation of standard strains; 6: Negative control

生化試驗結(jié)果如表1所示，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，初步判定分離菌株為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

表1 分離株及標(biāo)準(zhǔn)株的生化特性鑒定統(tǒng)計Table 1 Statistical table for identification of biochemical characteristics of isolates and standard strains

2.4 細(xì)菌毒素的多重PCR檢測 針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β、ε、τ四種毒素基因?qū)Ψ蛛x到的43株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行多重PCR鑒定分型的PCR凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，所有分離株均擴增出202 bp的單一條帶，與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因的擴增條帶吻合，說明分離的菌株全部為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌4種毒力基因的多重PCR鑒定Fig.3 Detection of 4 toxin genes of Clostridium perfringens by multiplex PCRM： DL-2 000； 1～11： 臨床分離株； 12： A型標(biāo)準(zhǔn)株； 13： 陰性對照M： DL-2 000; 1～11： Clinical isolates;12： Standard strain of type A; 13： Negative control

2.5 動物試驗結(jié)果 攻毒產(chǎn)氣莢膜梭菌上清液組小鼠在14 h內(nèi)全部死亡，而只攻毒細(xì)菌組與皰肉培養(yǎng)基對照組在整個觀察期內(nèi)未出現(xiàn)小鼠發(fā)病和死亡。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)腸道出血現(xiàn)象明顯，而攻毒細(xì)菌組和皰肉培養(yǎng)基對照組小鼠剖檢腸道均正常。

2.6 不同來源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性分析 藥敏試驗結(jié)果如圖4所示，43株不同來源的菌株對紅霉素、新霉素、卡那霉素有很高的耐藥性，耐藥率在80%以上，而對萬古霉素、米諾環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟的耐藥性相對較低。

圖4 產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥敏試驗Fig.4 Results of susceptibility test of Clostridium perfringens

2.7 不同來源產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rRNA進(jìn)化樹分析 選取前期不同宿主或不同地區(qū)分離的13株產(chǎn)氣莢膜梭菌與1株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株，利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴增，獲得了預(yù)期約1 400 bp 的目的條帶(圖略)。將測序獲得的16S rRNA 基因序列在GenBank進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明，擴增的細(xì)菌均為產(chǎn)氣莢膜梭菌，測序序列利用MEGA 7進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析(圖5)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，臨床分離的來自不同地區(qū)和不同宿主的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌基于16S rRNA基因序列水平上的進(jìn)化關(guān)系沒有明顯規(guī)律，不同宿主來源的菌株反而比相同宿主來源的菌株親緣關(guān)系更近。

圖5 不同來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA序列進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree by 16S rRNA of Clostridium perfringens from different sources

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌主要通過在腸道定殖后分泌毒素對腸黏膜造成損傷，引起壞死性腸炎的典型癥狀[11]。由于正常動物腸道中也可以分離到該菌，一般認(rèn)為引起壞死性腸炎癥狀的數(shù)量需達(dá)到106CFU/g以上[8]，所以對臨床可疑病例應(yīng)進(jìn)行該菌的活菌計數(shù)。本試驗選擇了傾注平板法進(jìn)行活菌計數(shù)，相較其他菌落計數(shù)方法，結(jié)果更為可靠。在細(xì)菌分離過程中，不能單純根據(jù)在TSC培養(yǎng)基上呈現(xiàn)周圍有白色渾濁圈的黑色菌落特征作為判定產(chǎn)氣莢膜梭菌的唯一依據(jù)，實驗室曾分離到在TSC平板上具有該菌典型菌落特征但不能分解棉子糖和不產(chǎn)生爆烈發(fā)酵現(xiàn)象的菌株，經(jīng)鑒定，該菌為爪狀芽孢梭菌，所以需要結(jié)合生化試驗和測序進(jìn)行綜合判斷。對于產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型，Kokeala H A等[12]通過毒素中和試驗與多重PCR比較發(fā)現(xiàn)2種方法的結(jié)果一致，相比較而言，多重PCR更省時省力且快速，所以多重PCR技術(shù)在臨床應(yīng)用中比毒素中和試驗具有更大的優(yōu)勢。本試驗分別通過注射細(xì)菌和上清液的方式對小鼠進(jìn)行了攻毒，發(fā)現(xiàn)上清液是導(dǎo)致動物死亡的主要因素，進(jìn)一步說明產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素是主要致病因子。

本試驗選取了臨床常用的7類抗生素中的15種，通過紙片法藥敏試驗對不同宿主來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行的耐藥性分析結(jié)果表明，分離菌株對選擇的15種抗生素具有不同程度的耐藥性。治療產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸炎，青霉素是臨床上常用藥物，但極易產(chǎn)生耐藥性，本試驗分離到的菌株對青霉素的耐藥率達(dá)到了23%，萬古霉素作為一種超級抗生素，本試驗分離到菌株對其全部敏感，并未發(fā)現(xiàn)超級耐藥菌的出現(xiàn)。該藥敏試驗結(jié)果可對臨床防治梭菌性腸炎提供一定的參考依據(jù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹是檢測物種進(jìn)化關(guān)系的常用方法，本試驗對不同地區(qū)和不同宿主來源的14株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株在分布地區(qū)、宿主來源沒有明顯的規(guī)律，即A型菌株即使來源不同，但同源性差異不大，說明該菌不具有宿主特異性，可能與來源于環(huán)境有關(guān)。另外，16S rRNA基因序列保守性較強，用于同源性較近的菌株分類具有一定局限性。