陳雅婕，祝子伏，楊玉榮，劉 群，劉 晶

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 國家動物寄生原蟲實驗室 農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點實驗室，北京 海淀 100193；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

住肉孢子蟲(Sarcocystis)、新孢子蟲(Neosporacaninum)和弓形蟲(Toxoplasmagondii)均是專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的頂復(fù)亞門原蟲，呈世界性分布[1-3]。三者親緣關(guān)系相近，生活史相似，發(fā)育階段需要更換宿主，且宿主范圍極為廣泛[4-6]，綿羊是這3種原蟲的常見中間宿主。我國報道的綿羊住肉孢子蟲流行株為柔嫩住肉孢子蟲(S.tenella)、巨型住肉孢子蟲(S.gigantea)和褐犬住肉孢子蟲(S.arieticanis)[7]。住肉孢子蟲多以包囊形式寄生于綿羊的橫紋肌[4]，大量寄生可影響肉品質(zhì)量，嚴(yán)重時導(dǎo)致羊肉制品的廢棄；少數(shù)住肉孢子蟲(如S.tenella)嚴(yán)重時可寄生于綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致綿羊出現(xiàn)神經(jīng)癥狀甚至死亡[6]。住肉孢子蟲存在嚴(yán)格的宿主特異性，蟲株不同以及感染數(shù)量的差異均會影響其致病性[6]。弓形蟲和新孢子蟲感染綿羊主要引起孕畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙和新生胎兒運動神經(jīng)系統(tǒng)障礙[2-3]。其中，弓形蟲病又是人獸共患寄生蟲病，弓形蟲容易隨著羊肉進(jìn)入人類食物鏈，引起食源性弓形蟲感染。在實際生產(chǎn)中，住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲常出現(xiàn)混合感染的情況，危害人類健康，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

為研究住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲在綿羊中的感染情況，我們采集了114份心肌樣品、61份食道樣品和131份血清樣品，利用組織壓片鏡檢和間接ELISA的方法對住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲的病原或抗體進(jìn)行了檢測，為進(jìn)一步了解3種原蟲的混合感染情況，有效防控綿羊感染3種寄生蟲提供了可借鑒的資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料 樣品采自河南焦作某地區(qū)數(shù)家散養(yǎng)戶，隨機(jī)采樣114個心臟、61個食道以及131份血清樣品；采集的心臟和食道樣品冷卻至室溫后置于4 ℃冰盒中保鮮，血清樣本于-80 ℃保存；弓形蟲和新孢子蟲陽性血清，由國家動物寄生原蟲實驗室制備并保存；胃蛋白酶，購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和新生牛血清，均購自北京邁晨科技有限公司；全血組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物技術(shù)公司；Donkey anti-goat IgG HRP，購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 倒置熒光顯微鏡IX70，購自日本Olympus公司；熒光倒置顯微鏡ECLIPSE Ts2R，購自日本Nikon公司；PCR儀，購自美國BIO-RAD公司；微孔板分光光度計，購自美國Bio-Tek公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織壓片 分別觀察心肌樣品和食道樣品有無肉眼可見的住肉孢子蟲包囊。在心肌樣品和食道肌樣品上順肌纖維方向隨機(jī)取2處米粒大小的肌肉置于載玻片上，用蓋玻片蓋住后緩慢輕壓，使其變薄。將玻片置于光學(xué)顯微鏡下，利用10×20倍鏡和10×40倍鏡分別觀察住肉孢子蟲包囊并通過倒置熒光顯微鏡IX70拍照留存。

1.3.2 住肉孢子蟲的純化 取心臟和食道樣品(約25 g)于攪拌機(jī)中攪至肉泥狀，加入生理鹽水和胃蛋白酶(1∶1混合)，放入500 mL錐形瓶中，37 ℃搖床消化50 min。用篩子去除未消化的肌肉組織，濾過的液體4 600 r/min離心4 min，棄去上清。加入5 mL碳酸氫鈉溶液搖勻，再加入生理鹽水至50 mL， 離心去上清，用生理鹽水重懸即獲得住肉孢子蟲緩殖子懸濁液。參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行密度梯度離心純化住肉孢子蟲緩殖子，置于熒光倒置顯微鏡ECLIPSE Ts2R下觀察。按照全血組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒的說明書對純化的緩殖子提取基因組DNA。剩余蟲體加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后加入二甲基亞砜，-80 ℃保存。

1.3.3 PCR 根據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，擴(kuò)增住肉孢子蟲18S rRNA，引物序列為Sar-F：5′-GCACTTGATGAATTCTGGCA-3′，Sar-R：5′-CACCACCCATAGAATCAAG-3′。反應(yīng)體系：2×Taq酶25 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察其條帶大小，將大小符合預(yù)期的條帶切下送檢測序。檢測結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.3.4 間接ELISA 依據(jù)實驗室前期建立的間接ELISA方法檢測新孢子蟲和弓形蟲抗體。參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行新孢子蟲特異性抗體檢測，用分光光度計讀取OD450 nm值和OD630 nm值。以O(shè)D450 nm/OD630 nm=0.185為臨界值，大于或等于臨界值為新孢子蟲抗體陽性；小于臨界值則為陰性；參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行弓形蟲特異性抗體檢測，用分光光度計讀取OD450 nm值。以0.158為臨界值，大于臨界值為弓形蟲抗體陽性；小于或等于臨界值則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 采樣情況 羊只均為12月齡左右的公綿羊，統(tǒng)一從內(nèi)蒙或山西引進(jìn)。羊群精神狀態(tài)較好，未見食欲低下，精神沉郁以及神經(jīng)癥狀；營養(yǎng)狀況普遍良好，體型適中；1只綿羊營養(yǎng)不良，體型消瘦，但經(jīng)鏡檢和間接ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)不良與3種原蟲寄生無相關(guān)性。

2.2 住肉孢子蟲感染情況 心臟和食道樣品均無肉眼可見的住肉孢子蟲包囊，但在鏡下觀察心臟陽性樣本壓片時可見與肌肉纖維平行且形態(tài)呈紡錘形的住肉孢子蟲包囊，內(nèi)含大量緩殖子，見圖1A，箭頭所指即為住肉孢子蟲包囊。因食道樣本中的住肉孢子蟲包囊數(shù)少，壓片鏡檢時未發(fā)現(xiàn)明顯包囊，改為采用先組織消化后鏡檢觀察的方法。樣本經(jīng)組織消化和密度梯度離心純化后可在鏡下觀察到呈月牙形或香蕉形的緩殖子，見圖1B和圖1C，箭頭所指即為住肉孢子蟲緩殖子。對采集的樣本鏡檢統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，心肌和食道樣品中均能檢測到住肉孢子蟲，心臟檢出率為35.96%，高于食道21.31%的檢出率。在這些樣本中，有13份心肌與食道樣品為同一來源，其中4份食道住肉孢子蟲陽性樣本的羊心臟檢測結(jié)果為陰性，9份食道陽性樣本羊的心臟中也檢測到住肉孢子蟲的包囊，最終綿羊住肉孢子蟲感染率為39.47%(45/114)。檢測結(jié)果說明住肉孢子蟲可同時寄生于心臟和食道，但心臟組織更適于住肉孢子蟲寄生且心尖檢出率最高。

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察住肉孢子蟲包囊及緩殖子Fig.1 Sarcocystis cysts and bradyzoites are observed by inverted fluorescence microscopesA:心尖組織壓片(200×)； B:食道樣品(400×)； C:心肌樣品(400×)A: Heart apical tissue compression (200×); B: Esophagus samples (400×); C:Heart samples (400×)

表1 綿羊不同組織住肉孢子蟲感染情況Table 1 Infection of Sarcocystis in different tissues of sheep

2.3 住肉孢子蟲的種屬鑒定 成功分離、純化的住肉孢子蟲為分子生物學(xué)研究提供了物質(zhì)保障。以純化的緩殖子(不同組織樣本中分離)中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增到600 bp左右的18S rRNA 單一條帶，見圖2。送檢測序后的結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對并利用Mega進(jìn)行繪圖，發(fā)現(xiàn)寄生于食道和心肌的住肉孢子蟲基因序列與S.tenella18S rRNA(MF039329.1)基因序列相似性分別為99.65%和99.48%，與巨型住肉孢子蟲18S rRNA(L24384.1)基因序列相似性分別為94.93%和95.34%。食道肌和心肌樣品中分離到的住肉孢子蟲與S.tenella的基因序列相似性極高，且樣品中未見巨型住肉孢子蟲特征性的肉眼可見的包囊，故判斷其為S.tenella。

2.4 新孢子蟲和弓形蟲感染情況 間接ELISA檢測結(jié)果顯示，此次采集的血清樣品中新孢子蟲和弓形蟲感染率分別為57.25%(76/131)和21.37%(28/131)，同時檢出弓形蟲和新孢子蟲抗體的樣本有22份，混合感染率為16.79%(22/131)。將心肌和食道肌樣本與血清樣本一一對應(yīng)，結(jié)合2.1中檢測到的住肉孢子蟲感染情況，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲和住肉孢子蟲、弓形蟲和住肉孢子蟲的混合感染率分別為21.92%(25/114)和9.64%(11/114)。3種原蟲檢測結(jié)果均為陽性的混合感染樣本有9份，感染率為7.89%(9/114)，見表2。檢測結(jié)果表明該地區(qū)綿羊3種原蟲均有感染，且存在較高的混合感染情況。

圖2 18S rRNA的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 18S rRNA by PCRM:DL-2 000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～3:心肌樣品;4～5:食道肌樣品; 6:巨型住肉孢子蟲 DNAM: DL-2 000 DNA Marker; 1～3: Heart samples;4～5: Esophageal samples; 6: S. gigantea DNA

3 討論

住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲是危害養(yǎng)殖業(yè)的3種頂復(fù)亞門原蟲。目前實驗室常用PCR法和血清學(xué)法對弓形蟲和新孢子蟲進(jìn)行檢測，但PCR法常受引物、樣品處理等影響，國際上未有統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)[3]，且其在臨床上多呈慢性感染，樣品如腦組織采集過于繁瑣。考慮2種原蟲可垂直傳播且感染后一般無法自愈，故應(yīng)用中更偏向于血清學(xué)方法診斷。住肉孢子蟲則因尚無特異性血清學(xué)診斷方法，多采用組織壓片鏡檢法檢測，后者敏感性顯著低于前者，易出現(xiàn)漏檢。住肉孢子蟲基因庫尚未公布，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)存在較大的局限，現(xiàn)主要利用核糖體小亞基(18S rRNA)[12]、核糖體大亞基(28S rRNA)[13]及線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(Cytochrome C oxidase subunit I,cox1)[12]研究其分型、種系發(fā)育以及流行病學(xué)調(diào)查[6]，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)[6]應(yīng)用較少。

表2 住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲感染情況Table 2 Infection of Sarcocystis,Neospora and Toxoplasma gondii

此次對河南焦作綿羊村綿羊住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)3種原蟲的感染率較高并存在一定的混合感染。其中新孢子蟲和住肉孢子蟲感染率(分別為57.25%和39.47%)顯著高于弓形蟲(21.37%)。同時，此次檢測出的住肉孢子蟲感染率(39.47%)略高于董輝等[14]報道的河南全省住肉孢子蟲感染率(32.48%)；新孢子蟲感染率(57.25%)顯著高于韓方潔[15]報道的河南安陽新孢子蟲感染率(37.35%)，推測這與飼養(yǎng)管理、綿羊來源等有密切關(guān)系。采樣地的綿羊宰殺點通常選址在養(yǎng)殖場門口，且養(yǎng)殖場周圍多飼養(yǎng)犬只用于管理羊群安全，導(dǎo)致犬只極易接觸到屠宰后的生羊肉和內(nèi)臟而被感染。犬是新孢子蟲和柔嫩住肉孢子蟲的終末宿主，感染犬排出的糞便含有新孢子蟲或柔嫩住肉孢子蟲的卵囊，污染養(yǎng)殖場的飲水、器具或飼料，導(dǎo)致綿羊再次感染新孢子蟲和柔嫩住肉孢子蟲。而貓是弓形蟲和巨型住肉孢子蟲的唯一終末宿主，接觸羊群的機(jī)會有限，這也解釋了新孢子蟲和住肉孢子蟲感染率比弓形蟲高以及未檢測出巨型住肉孢子蟲的情況，符合我國住肉孢子蟲流行現(xiàn)狀[16]。此外該村近年來統(tǒng)一利用高速運輸?shù)姆绞綇膬?nèi)蒙古或山西引進(jìn)5～6月齡的公綿羊(引入前、后并未檢測3種原蟲)，采用圈養(yǎng)的方式育肥至12月齡宰殺，平均養(yǎng)殖密度約100～200頭。據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)住肉孢子蟲陽性率高達(dá)57.14%[17]，新孢子蟲陽性率達(dá)23%[15]，推斷該村綿羊住肉孢子蟲和新孢子蟲感染率偏高可能源于引種地區(qū)即內(nèi)蒙古的高流行率。但鑒于目前尚未有山西綿羊住肉孢子蟲和新孢子蟲相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查，故無法明確引入地與引種地區(qū)間住肉孢子蟲和新孢子蟲流行率的具體關(guān)聯(lián)，還需進(jìn)一步調(diào)查。

不同檢測部位的住肉孢子蟲檢出率也存在差異。此次心肌檢出率(35.96%)顯著高于食道(21.31%)；Minuzzi C E等[16]檢測綿羊住肉孢子蟲時發(fā)現(xiàn)心肌檢出率(91.5%)高于食道(81.5%);李春花等[18]對青海省綿羊住肉孢子蟲進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)食道肌(77.23%)檢出率比心肌(64.36%)高；Fukuyo M等[19]用壓片法檢測綿羊住肉孢子蟲時發(fā)現(xiàn)舌肌檢出率最高，推測造成這種現(xiàn)象的原因可能與住肉孢子蟲的分型有關(guān)。雖然住肉孢子蟲可寄生于全身多處肌肉組織，但在組織器官分布中存在特異性[6]。本次分離所得為柔嫩住肉孢子蟲，其主要寄生于心肌、舌肌等部位[4]。

國內(nèi)綿羊住肉孢子蟲流行蟲株對人無明顯致病性[6]且多數(shù)綿羊呈隱形感染，故我國對住肉孢子蟲的檢疫與防控并不重視。然而有報道顯示，嚴(yán)重的柔嫩住肉孢子蟲感染可導(dǎo)致綿羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、神經(jīng)癥狀甚至是死亡[6]；巨型住肉孢子蟲的臨床癥狀不明顯，但其形成的包囊可嚴(yán)重影響肉質(zhì)，包囊破裂后還可導(dǎo)致周圍肌肉變性[7]。住肉孢子蟲全國各地均有報道，流行率極高且在臨床上常與弓形蟲、新孢子蟲混合感染，給養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)造成巨大損害。為控制3種原蟲的流行，我們應(yīng)重視3種疾病的宣傳教育；加強(qiáng)終末宿主的管理，不喂犬貓生羊肉、內(nèi)臟并嚴(yán)禁犬貓出入圈舍，切斷傳播途徑；保持舍內(nèi)清潔衛(wèi)生，提高綿羊的免疫力并避免飼料、飲水被污染；定點屠宰，減少犬貓接觸生羊肉和內(nèi)臟的機(jī)會；盡量避免從流行率高的地區(qū)引種綿羊。

4 結(jié)論

該地區(qū)綿羊存在住肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲3種原蟲的感染，且混合感染情況較為普遍。流行的住肉孢子蟲蟲種為柔嫩住肉孢子蟲。