馬晶晶，高俊鋒，吳碧清，韓相敏，張 江，賴 志

(1. 上海創(chuàng)宏生物科技有限公司，上海 松江 201619；2. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 松江 201699)

豬偽狂犬病(Pseudorahies，PR)是由皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科的豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies vires，PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物的以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀的一種急性傳染病。豬是本病的原發(fā)感染宿主，又是病毒的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和排毒者[1-2]。母豬主要造成繁殖障礙，仔豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、呼吸困難、拉稀等臨床癥狀。2011年后，我國(guó)多地區(qū)出現(xiàn)豬偽狂犬變異株并流行，引發(fā)豬只死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。

疫苗接種是防治豬偽狂犬病的重要手段之一。目前豬偽狂犬病常規(guī)疫苗在接種后雖然能預(yù)防臨床癥狀的出現(xiàn)，但不能防止強(qiáng)毒在被感染動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制、排出。有報(bào)道表明，新型自然弱毒株疫苗的應(yīng)用可控制豬偽狂犬病的潛伏感染[3-5]。

偽狂犬活疫苗C株疫苗毒株，自然缺失基因片段gI、gE、Us9、Us2，本試驗(yàn)擬通過(guò)中和抗體和攻毒保護(hù)試驗(yàn)對(duì)偽狂犬活疫苗C株的免疫原性進(jìn)行研究，并通過(guò)與常規(guī)疫苗Bartha株進(jìn)行比較，評(píng)估其作為疫苗的應(yīng)用，并為其在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，以加速偽狂犬病基因缺失疫苗在我國(guó)用于防治和根除偽狂犬病的進(jìn)程[6-8]。

1 材料與方法

1.1 強(qiáng)毒株 偽狂犬病病毒HB-11株，新流行野毒株，由上海創(chuàng)宏生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)用疫苗 豬偽狂犬活疫苗C株，購(gòu)自武漢中博生物股份有限公司。

1.3 偽狂犬Bartha株疫苗 購(gòu)自西班牙海博萊生物大藥廠。

1.4 細(xì)胞系 非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，由上海創(chuàng)宏生物科技有限公司提供。

1.5 參照抗原和陽(yáng)性血清 試驗(yàn)用抗原為偽狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物,中和抗體效價(jià)為1∶256；陽(yáng)性血清為豬偽狂犬病病毒感染血清，中和抗體效價(jià)為1∶256。參照抗原和陽(yáng)性血清均由上海創(chuàng)宏生物科技有限公司制備和保存。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物 斷奶仔豬，40頭，4周齡。所有動(dòng)物在試驗(yàn)前均經(jīng)乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)為偽狂犬病病毒血清學(xué)陰性。試驗(yàn)在嚴(yán)格隔離條件下進(jìn)行。由上海交通大學(xué)七寶校區(qū)試驗(yàn)豬場(chǎng)提供。

1.7 方法

1.7.1 抗體消長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將偽狂犬抗體陰性的健康斷奶仔豬20頭，隨機(jī)分成A、B兩組，每組10頭。A組：免疫組，頸部肌肉注射豬偽狂犬活疫苗C株1 mL，接種劑量為106.5TCID50；B組：對(duì)照組，頸部肌肉注射DMEM培養(yǎng)基1 mL。分別在接種前1天(記為D1)、接種后第3天(記為D3)、第7天(記為D7)、第14天(記為D14)、第21天(記為D21)、第28天(記為D28)、第42天(記為D42)、第60天(記為D60)、第90天(記為D90)、第180天(記為D180)對(duì)每頭豬進(jìn)行采血，分離血清。然后使用固定病毒稀釋血清方法測(cè)定中和抗體效價(jià)。

1.7.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將偽狂犬抗體陰性的健康斷奶仔豬20頭，隨機(jī)分成C、D、E、F四組，每組5頭。C組：C株免疫組，頸部肌肉注射豬偽狂犬活疫苗C株1 mL，接種劑量為106.5TCID50；D組:Bartha株免疫組，頸部肌肉注射偽狂犬病毒Bartha株活疫苗1 mL， 接種劑量為106.5TCID50；E組：攻毒對(duì)照組，頸部肌肉注射DMEM培養(yǎng)基1 mL；F組：空白對(duì)照組。在接種后第21天，C、D、E組每頭豬頸部肌肉注射偽狂犬病毒HB-11株病毒液1 mL，病毒含量為106.5TCID50。攻毒后，在第1、3、5、7、14天測(cè)量試驗(yàn)豬體溫，每天1次，詳細(xì)記錄體溫變化；此外，每天觀察各組豬群是否出現(xiàn)體溫升高、食欲廢絕、呼吸困難、神經(jīng)癥狀、拉稀和嘔吐等臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)臨床癥狀數(shù)據(jù)，觀察至攻毒后第21天；每組隨機(jī)選取2只剖檢，觀察腦部、肺部、扁桃體、肝臟、脾臟、腎臟等病理變化[9]。分別在D1、D3、D7、D14、D21、D28、D42、D60、D90、D180對(duì)存活豬進(jìn)行采血，分離血清，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理后，采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析及LSD法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 抗體消長(zhǎng)規(guī)律試驗(yàn) 免疫接種偽狂犬活疫苗C株后，持續(xù)檢測(cè)6個(gè)月的抗體水平，結(jié)果表明，偽狂犬活疫苗C株免疫后在D7可以檢測(cè)到中和抗體，并且抗體水平不斷上升，D42達(dá)到抗體水平高峰，D180抗體水平仍高于20，對(duì)照組(B組)抗體檢測(cè)結(jié)果一直為陰性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 C株病毒免疫豬群后免疫組與對(duì)照組中和抗體消長(zhǎng)規(guī)律圖Fig.1 The growth and loss of neutralizing antibody with strain C between the immunized group and the control group

2.2 攻毒試驗(yàn)

2.2.1 攻毒后體溫測(cè)定 攻毒對(duì)照組(E組)在D3和D5的體溫超過(guò)40.5 ℃，Bartha株免疫組(D組)在D3的體溫超過(guò)40.5 ℃，C株免疫組(C組)體溫?cái)?shù)據(jù)均低于40 ℃。方差分析結(jié)果顯示，各測(cè)溫時(shí)間點(diǎn)C組與E組均存在顯著差異(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 攻毒后體溫Table 1 Temperature after challenge

2.2.2 攻毒后臨床癥狀的觀察 D組和E組出現(xiàn)發(fā)熱、厭食和呼吸困難等癥狀；E組發(fā)病率100%(5/5)，表現(xiàn)為發(fā)燒、精神沉郁、呼吸困難，嚴(yán)重的仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，其中2頭豬分別在第3天和第4天死亡。C組80%(4/5)以上仔豬表現(xiàn)為精神、呼吸、采食均正常，保護(hù)率不低于80%；F組仔豬均表現(xiàn)正常。

3.2.3 剖檢病變 C組和F組剖檢無(wú)明顯病變；D組剖檢有病變；E組剖檢病變明顯：腦膜充血出血，扁桃體出血，肺臟出現(xiàn)白色壞死灶，肝臟、脾臟顆粒狀出血點(diǎn)明顯。見(jiàn)中插彩版圖2。

圖2 攻毒對(duì)照組剖檢病變Fig.2 Lesions in the challenge control group

3.2.4 病毒血癥 C組較D組病毒血癥持續(xù)時(shí)間短，病毒載量低，F(xiàn)組未檢出病毒。見(jiàn)表2。

表2 病毒載量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Viral load detection results

4 討論

豬偽狂犬病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大，引起的經(jīng)濟(jì)損失也難以估量，這也是目前很多國(guó)家將其作為凈化對(duì)象的重要原因。在我國(guó)，一直以來(lái)均依賴疫苗免疫進(jìn)行防控。所以對(duì)于豬偽狂犬病病毒和相關(guān)疫苗的分析研究至關(guān)重要[10-12]。

固定病毒稀釋血清方法是檢測(cè)豬偽狂犬病病毒抗體的可靠方法，目前許多國(guó)家將其列為法定的檢測(cè)方法。豬偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科，中和抗體效價(jià)不高，在其判定上，有不少學(xué)者以血清1∶2的稀釋度是否出現(xiàn)細(xì)胞病變作為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也有許多學(xué)者認(rèn)為，動(dòng)物體的中和抗體效價(jià)小于1∶2時(shí)，也不能說(shuō)明動(dòng)物就一定是陰性，沒(méi)有感染豬偽狂犬病病毒。此外，豬偽狂犬病的免疫機(jī)理也很復(fù)雜，既有體液免疫，又有細(xì)胞免疫的參與。有的學(xué)者通過(guò)試驗(yàn)得出：某些動(dòng)物經(jīng)注射疫苗后，中和抗體水平?jīng)]有轉(zhuǎn)陽(yáng)，但通過(guò)攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同樣具有保護(hù)性。該病毒的這些特性，給豬偽狂犬病的臨床診斷和疫苗效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)帶來(lái)了復(fù)雜性。目前，一般將疫苗效果的界限定為：中和效價(jià)≥1∶2或中和抗體指數(shù)≥102.5時(shí)為血清抗體陽(yáng)性[13]。

本試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)豬的抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，偽狂犬活疫苗C株免疫組在第7天就產(chǎn)生了中和抗體，并持續(xù)升高，在42 d達(dá)到高峰，在180 d中和抗體水平仍高于保護(hù)值，表明偽狂犬活疫苗C株免疫保護(hù)期可持續(xù)6個(gè)月。

攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，攻毒對(duì)照組發(fā)病率100%，表現(xiàn)為發(fā)燒、精神沉郁、呼吸困難，嚴(yán)重的仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡；空白對(duì)照組仔豬均表現(xiàn)正常；C株免疫組80%以上仔豬表現(xiàn)為精神、呼吸、采食均正常，保護(hù)率不低于80%。在對(duì)免疫接種豬剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種豬偽狂犬活疫苗C株試驗(yàn)組的內(nèi)臟無(wú)明顯病理變化，而B(niǎo)artha株試驗(yàn)組和攻毒對(duì)照組的內(nèi)臟都出現(xiàn)不同程度的出血和病變，且病毒血癥偽狂犬活疫苗C株較Bartha株持續(xù)時(shí)間短，病毒含量低。