趙燕燕，劉勇，李乾

[1.空軍特色醫(yī)學(xué)中心(原空軍總醫(yī)院)眼科，北京 100142；2.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081]

青光眼是一組復(fù)雜的慢性進(jìn)行性視神經(jīng)損害性疾病，臨床特點(diǎn)為眼壓升高、視盤(pán)凹陷和萎縮、視野缺損，是目前全球視力損害和致盲的第二大疾病。原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary openangle glaucoma，POAG)是青光眼的主要類(lèi)型之一，有青光眼家族史的患者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高7～10倍。POAG的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，遺傳因素和環(huán)境因素均可影響該病的發(fā)生，而遺傳因素是POAG的主要因素。目前已發(fā)現(xiàn)與POAG相關(guān)的基因突變位點(diǎn)至少有20個(gè)。全外顯子測(cè)序技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、高通量及高速度等特點(diǎn)，被越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床基因篩查和診斷中。本研究對(duì)1個(gè)POAG家系患者進(jìn)行臨床表型的研究，并應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)致病基因進(jìn)行了篩查，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2017年在空軍特色醫(yī)學(xué)中心(原空軍總醫(yī)院)就診的1例POAG患者，通過(guò)詳細(xì)詢問(wèn)及遺傳學(xué)調(diào)查，分析其家系遺傳特征，繪制系譜圖。對(duì)該患者及其可獲得的家系成員進(jìn)行全面的眼科檢查，包括視力、最佳矯正視力、眼壓(Goldman非接觸眼壓計(jì))、裂隙燈顯微鏡、眼底檢查、前房角鏡、視野(Humphrey自動(dòng)視野計(jì))、相干光斷層掃描檢查。POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)(參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)青光眼學(xué)組推薦標(biāo)準(zhǔn))：1)兩眼中至少1只眼眼壓持續(xù)＞21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；2)前房角鏡檢測(cè)為開(kāi)角；3)眼底存在青光眼特征性視網(wǎng)膜視神經(jīng)損害和視野損害；4)沒(méi)有與眼壓升高相關(guān)的病因性眼部或全身其他異常。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽取各受試者外周血5 mL，進(jìn)行EDTA抗凝，于-20 ℃冰箱中保存。采用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。本研究經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心(原空軍總醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)，并遵循赫爾辛基宣言涉及人類(lèi)受試者的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.2.2 全外顯子測(cè)序

基因組DNA送北京貝瑞和康生物有限公司，進(jìn)行人類(lèi)全基因組外顯子高通量基因測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)凈質(zhì)量控制后，應(yīng)用BWA軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，采用GATK和VarScan軟件對(duì)單個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、小的缺失和插入進(jìn)行分析，應(yīng)用dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)、ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1 000 g)及100名正常對(duì)照人群SNP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，將突變頻率＜0.01的變異視為可疑變異，應(yīng)用Polyphen-2和SIFT軟件對(duì)可疑突變進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)，同時(shí)使用基因突變相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)HGMD和Clinvar進(jìn)一步對(duì)可疑致病位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，找出致病位點(diǎn)肌纖蛋白(myocilin，MYOC)基因的c.754G＞A。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)全外顯子測(cè)序結(jié)果，采用Sanger測(cè)序?qū)ο茸C者及其家系成員進(jìn)行突變結(jié)果驗(yàn)證。針對(duì)MYOC基因的c.754G＞A突變，應(yīng)用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，并合成基因引物。

1.2.4 PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段

采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將產(chǎn)物進(jìn)行純化，應(yīng)用美國(guó)ABI公司的3730xl型測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中的MYOC基因第3外顯子正常序列(GenBank NM_000261)進(jìn)行BLAST比對(duì)，記錄對(duì)比結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床資料

患者，女，39歲，反復(fù)頭疼17年，2017年5月23日于空軍特色醫(yī)學(xué)中心(原空軍總醫(yī)院)眼科首診。體格檢查：右眼視力1.2，左眼視力1.2；右眼眼壓21.5 mmHg，左眼眼壓25.7 mmHg。雙角膜透明，前房中深，晶體透明，瞳孔對(duì)光反射靈敏，眼底見(jiàn)視盤(pán)界清，色正，C/D 0.8～0.9，視網(wǎng)膜血管走形比例可，黃斑中反清晰。房角鏡檢查：雙眼360°寬角，無(wú)房角粘連和房角發(fā)育異常。動(dòng)態(tài)視野：右眼鼻下與生理盲點(diǎn)相連的視野缺損，左眼顳側(cè)和鼻下視野缺損。視盤(pán)光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)：右眼上方神經(jīng)纖維層變薄，左眼鼻側(cè)和上方神經(jīng)纖維層變薄。視神經(jīng)纖維變薄區(qū)與視野缺損區(qū)相對(duì)應(yīng)(圖1)。24 h眼壓監(jiān)測(cè)陽(yáng)性(最低：右眼10.3 mmHg，左眼11.7 mmHg；最高：右眼29.3 mmHg，左眼31 mmHg；壓差：右眼19 mmHg，左眼19.3 mmHg)。臨床診斷：雙眼POAG。給予“曲伏前列腺素滴眼液，點(diǎn)雙眼，每晚1次；卡替洛爾滴眼液，點(diǎn)雙眼，每日2次”治療，定期復(fù)查眼壓均位于正常范圍，隨訪至2019年8月，視神經(jīng)纖維層輕度變薄，視野損害略有進(jìn)展(圖2，圖3)。

圖1 初次及末次就診時(shí)眼底像、視盤(pán)OCT及視野圖Figure 1 Optic disc appearance,optical coherence tomography and visual field findings of the proband at the initial and final visits

2.2 家系患者臨床資料

該家系4代共18人，其中POAG患者共8人，男3人，女5人。本家系連續(xù)4代發(fā)病，以垂直方式從一代傳到下一代連續(xù)傳遞，男女均發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳方式(圖4)。該家系中，先證者之姐(III13，48歲)、母親(II5，73歲)、外祖母(I2)，其母親的一個(gè)姐姐(II4，75歲)，3個(gè)弟弟(II7，72歲；II8，70歲；II9，67歲)均患有POAG?；颊?III14)確診年齡為39歲，確診時(shí)視野已出現(xiàn)顯著損害，其姐姐(III13)42歲因頭疼就診，確診為POAG(晚期)，行小梁切除手術(shù)治療，但目前(48歲)已致盲(管狀視野)。

圖2 視盤(pán)OCT示神經(jīng)纖維層厚度3年隨訪變化Figure 2 OCT revealing RNFL changes in 3-year follow-up

圖3 視野損害指數(shù)MD及PSD值3年隨訪變化Figure 3 Changes in MD and PSD in 3-year follow-up

圖4 該譜系中的主要個(gè)體Figure 4 Principal individuals from this pedigree

2.3 基因突變結(jié)果

經(jīng)dbSNP137，ESP6500，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，ExAC等數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾篩選以后，在先證者1號(hào)染色體MYOC基因第3外顯子發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變c.754G＞A，該突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)翻譯在252位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?p.Gly252Arg)。該變異已被HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，且Clin Var數(shù)據(jù)庫(kù)將其定義為致病性突變。Sanger測(cè)序驗(yàn)證先證者攜帶的MYOC基因c.754G＞A(p.Gly252Arg)突變，在另外2個(gè)非患病家系成員(IV18，20歲；III11，50歲)中未發(fā)現(xiàn)該突變(圖5)。

圖5 先證者(III14)及其家族成員(IV18，III11)的測(cè)序結(jié)果Figure 5 Sequencing results in the proband (III14) and her family members (IV18,III11)

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)與POAG相關(guān)的基因約20個(gè)，MYOC基因是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)[1]、也是最常見(jiàn)的一個(gè)致病基因[2]。MYOC基因位于1號(hào)染色體lq21-31的GLClA位點(diǎn)[3]，該基因編碼長(zhǎng)為504個(gè)氨基酸的一種多肽糖蛋白[4]。MYOC基因變異至少有270多種，超過(guò)半數(shù)的MYOC基因變異導(dǎo)致青光眼[5]，MYOC基因突變占POAG患者的2%～4%[6]和J-POAG的22%～36%[7]。多數(shù)致病突變集聚在第3個(gè)外顯子上，較少位于第1、第2外顯子，啟動(dòng)子、內(nèi)含子1、內(nèi)含子2也有基因突變的報(bào)道[8]。MYOC普遍存在人的各種組織中，在眼組織特別是小梁、睫狀體中濃度較高[9]，可能在細(xì)胞外基質(zhì)相互作用[10]、細(xì)胞遷移[11]、線粒體功能[12]方面發(fā)揮作用。變異型MYOC基因的產(chǎn)生改變了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其功能受到影響[13]，基因變異可以導(dǎo)致蛋白在小梁網(wǎng)表面的錯(cuò)誤折疊和積聚，導(dǎo)致不溶性蛋白在小梁網(wǎng)細(xì)胞中的聚集[14]，致組織裂解或細(xì)胞死亡，引起細(xì)胞外基質(zhì)組成的改變[15]，通過(guò)改變細(xì)胞骨架的性狀，影響小梁網(wǎng)細(xì)胞的正常功能，使房水流出通道受阻[16]，眼壓升高最終誘導(dǎo)POAG的產(chǎn)生。Kalrali等[17]還發(fā)現(xiàn)：MYOC在鞏膜篩板及視網(wǎng)膜的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突及星狀膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，因此還可能通過(guò)影響鞏膜篩板及視網(wǎng)膜的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能和存活性，來(lái)促進(jìn)青光眼的發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)1個(gè)POAG常染色體顯性遺傳家系研究，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶MYOC基因的c.754G＞A(p.Gly252Arg)突變，而在另外2個(gè)非患病家系成員中未發(fā)現(xiàn)該突變。c.754G＞A位于MYOC基因第3外顯子，在以往的研究[6-7]中，正常人群均未發(fā)現(xiàn)該變異，因此被認(rèn)為是致病突變而非基因多態(tài)性。

c.754G＞A(p.Gly252Arg)突變?cè)徽J(rèn)為與青少年起病的POAG(J-POAG)表型相關(guān)。該突變最先由Richards等[18]通過(guò)對(duì)一個(gè)美國(guó)的高加索人家系研究發(fā)現(xiàn)；之后Booth等[19]報(bào)道了1個(gè)蘇格蘭人大家系；Willoughby等[20]報(bào)道了1個(gè)兩代的新加坡華人家系。但攜帶MYOC Gly252Arg基因突變的患者并非為青少年時(shí)發(fā)病，有1例日本裔患者于49歲時(shí)確診POAG。Hewitt等[21]報(bào)道了1個(gè)澳大利亞大家系，該家系患者平均確診年齡為31～60(46.3±11.4)歲。Booth等[19]通過(guò)房角鏡檢查，發(fā)現(xiàn)攜帶該突變的患者房角存在異常血管，即中胚層組織殘留，但Hewitt等[21]的研究并沒(méi)有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，且家系的患者病情較輕，發(fā)病年齡明顯大于之前報(bào)道的家系患者[18-19]，其原因可能為上述房角結(jié)構(gòu)的差異。

本研究首次在中國(guó)人POAG家系中發(fā)現(xiàn)MYOC基因的c.754G＞A(p.Gly252Arg)突變，該家系患者年齡明顯大于之前報(bào)道的華人家系[20]的年齡?？赡苡幸恍┪粗囊蛩?，如環(huán)境或表觀遺傳因素，導(dǎo)致了這種表型上的差異。本研究擴(kuò)展了中國(guó)人群POAG致病基因變異譜，研究結(jié)果為家系的遺傳診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。下一步擬進(jìn)一步擴(kuò)大篩查范圍，對(duì)可采集的所有家系成員均進(jìn)行基因突變的篩查工作，進(jìn)一步證實(shí)該變異位點(diǎn)的致病性。