劉小天，龔雁，周璐

(寧波市眼科醫(yī)院 1.眼科；2.藥劑科，浙江 寧波 315040)

角膜堿燒傷是常見的眼科急重癥，其引起的角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是十分常見的眼病，約占整個角膜疾病的10%[1]。CNV形成通常與眼表和角膜的炎性、感染性、創(chuàng)傷性、毒性、退行性或免疫性疾病相關(guān)[2-3]。由于水腫、瘢痕形成或脂質(zhì)沉積，CNV可能導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害甚至失明[4]。目前對CNV的治療主要包括抗炎藥物、光動力療法、激光光凝以及結(jié)膜、角膜緣或羊膜移植，而所有這些醫(yī)療和外科干預(yù)措施的臨床療效有限，不良反應(yīng)也不少[5]。在CNV生成的過程中，CNV由多種刺激和抑制因子調(diào)節(jié)[6]，而在各種促血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族在刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成中起至關(guān)重要的作用[7]。其中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)的酪氨酸激酶在介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，毛細(xì)血管形成及其滲透性方面起重要作用[8-9]，尼達(dá)尼布(Nintedanib)是一種酪氨酸激酶抑制劑。近年來，根據(jù)CNV的形成機(jī)制，越來越多的藥物已經(jīng)被研究出來，但Nintedanib與CNV生長及消退的關(guān)系國內(nèi)報道尚少。本研究使用不同濃度Nintedanib滴眼液滴眼，并通過裂隙燈顯微鏡、病理及免疫組織化學(xué)等不同方法，觀察堿燒傷后CNV生成及抑制情況，探討Nintedanib治療角膜堿燒傷的作用，為新藥開發(fā)及該病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用上海SLAC實驗動物有限公司的成年SD雄性大鼠30只，體重為200～300 g，符合國家醫(yī)用動物使用標(biāo)準(zhǔn)。用裂隙燈顯微鏡檢查大鼠眼角膜正常。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組，每組各6只。A組、B組、C組分別給予0.2%，0.05%，0.02%的Nintedanib滴眼液滴眼，D組給予0.1%地塞米松滴眼，E組給予生理鹽水滴眼。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑與儀器包括裂隙燈顯微鏡數(shù)字圖像處理系統(tǒng)(日本，TOPCON SL-D2)、眼科手術(shù)器械(顯微剪刀、顯微鑷子，蘇州市協(xié)和醫(yī)療器械有限公司)、重組Anti-CD31抗體、山羊抗兔IgG H&L(Abcam公司，上海)、VEGF抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、Nintedanib(上海生工生物有限公司)、蘇木精-伊紅染色試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、切片機(jī)、脫水機(jī)(德國徠卡公司)。

1.3 建立大鼠角膜堿燒傷新生血管生長的動物模型

5組均以相同的方法制作左眼堿燒傷CNV模型。堿燒傷模型制備前1 d予以左眼氧氟沙星滴眼液和1%阿托品眼液點(diǎn)眼，用乙醚全身麻醉，堿燒傷時在模具內(nèi)滴入200 μL 1 mol/L NaOH溶液后，將模具垂直放置于大鼠左眼角膜中央，40 s后取出，迅速用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊1 min。燒灼角膜后立即滴入各組滴眼劑，4次/d，每次間隔5～6 h。實驗結(jié)束后，常規(guī)滴用氧氟沙星滴眼液4次/d，1滴/次，用藥3 d，預(yù)防感染。同于給予阿托品點(diǎn)眼擴(kuò)大瞳孔，便于觀察新生血管。SD大鼠飼養(yǎng)于寧波大學(xué)SPF級動物實驗室，本研究所采用的各種動物實驗操作均經(jīng)動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.4 Nintedanib滴眼液的制備和干預(yù)方法

以10%的2-羥丙基環(huán)糊精作為增溶劑，磷酸鈉單水合物作為緩沖劑，氯化鈉為增稠劑，注入水，配成無菌、不含防腐劑的等張液，20 min 37 ℃水浴至完全溶解，控制pH值為7.3～7.5。根據(jù)溶解度觀察，并以半個log遞減，配置成0.2%，0.05%，0.02%的Nintedanib滴眼液。5組滴眼液于4 ℃冰箱保存，各組大鼠均于造模當(dāng)天開始滴眼。每組 4 次/d，共 14 d。

1.5 裂隙燈檢查和 CNV 面積

每組大鼠分別于堿燒傷后第3，7，14天裂隙燈下觀察大鼠角膜創(chuàng)傷愈合、炎癥反應(yīng)及CNV生長情況的圖像，于角膜堿燒傷后第3，7，14天照相，并通過ImageJ軟件計算CNV的面積占全角膜面積的百分比(圖1)。觀察是否存在前房出血、角膜潰瘍及眼內(nèi)炎，將發(fā)生嚴(yán)重前房血、角膜潰瘍穿孔及眼內(nèi)炎者剔除。

1.6 HE染色與免疫組織化學(xué)檢測

造模后第14天，頸椎脫臼處死所有小鼠。取帶1 mm寬鞏膜的全角膜，置于4%甲醛溶液中進(jìn)行組織病理學(xué)檢查固定24 h，隨后用PBS沖洗除去甲醛后，將標(biāo)本包埋在石蠟中，冷卻凝固。將石蠟塊切成4～5 mm厚，切片用HE染色。切片脫蠟至水，加入3% H2O2液中10～20 min，水洗(抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性)，枸櫞酸緩沖液熱處理修復(fù)15～20 min。PBS洗3次，滴加10%正常血清封閉30 min(室溫或37 ℃)，滴加稀釋的一抗(VEGFG-2以1:400稀釋，CD31以1:2 000稀釋)，濕盒內(nèi)37 ℃孵育60 min或4 ℃過夜。PBS洗5 min，3次，滴加熒光二抗(均以1:200稀釋)，37 ℃孵育30～40 min，PBS洗5 min，3次，DAPI染核封片，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或核膜上呈綠色、藍(lán)色者為陽性，不顯色的為陰性。利用圖像分析儀(Image Pro Plus 6.0)測定免疫熒光染色陽性反應(yīng)物的IOD值以反映各組標(biāo)本檢測的蛋白相對含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計資料和隨機(jī)區(qū)組資料的方差分析，檢驗水準(zhǔn)：α=0.050。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 通過ImageJ軟件計算角膜新生血管的面積占全角膜面積的百分比Figure 1 The percentage of the area of corneal neovascularization to the total corneal area calculated with ImageJ software

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠 CNV

采用裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠CNV，大鼠角膜堿燒傷后第3天，A組、B組和C組中角鞏膜緣血管擴(kuò)張，未見明顯的新生血管生長；D組、E組角膜淺基質(zhì)層輕中度混濁，可見新生血管出芽，由周邊角膜緣向角膜中間蔓延，血管生長致密，相互交叉成網(wǎng)。堿燒傷后第7天，A組、B組、C組和D組新生血管管徑細(xì)小，多集中于角膜緣且生長緩慢；與B組、C組相比，A組新生血管少；D組、E組水腫明顯，新生血管生長旺盛，血管顯著變長、增粗，并在頂端出現(xiàn)分叉，虹膜上遍布呈刷狀的血管。堿燒傷后第14天，A組與B組血管床附近細(xì)小血管基本退化，分布局限且稀疏；A組新生血管的生長范圍、數(shù)量及長度均較B組與D組輕；C組、E組新生血管面積較大，CNV呈粗大致密(圖2)。

2.2 CNV 面積及其在角膜面積的占比

堿燒傷后第3，7，14天，通過ImageJ軟件測算五組CNV面積在角膜面積中的占比(C/N)(圖2)，結(jié)果顯示：堿燒傷后第3天，A組、B組與C組、D組、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，同時C組和E組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，第7天、第14天，A組、B組、C組和D組的C/N均小于E組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，其B組、D組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，但B組、D組分別A組、C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01；圖3，表1)。

2.3 常規(guī)病理切片觀察

堿燒傷后第3天，五組的角膜均出現(xiàn)上皮細(xì)胞腫脹，燒傷區(qū)可見部分上皮細(xì)胞缺如，細(xì)小點(diǎn)狀炎性細(xì)胞浸潤，未見前彈力層結(jié)構(gòu)，A組近角膜緣處淺基質(zhì)層可見CNV管腔，管徑較小，其中D組、E組見上皮細(xì)胞水腫更明顯，炎性細(xì)胞浸潤范圍更大。制模后第7天，A組可見角膜基質(zhì)層結(jié)構(gòu)整齊，少許新生血管管腔，角膜內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤；B組、D組角膜基質(zhì)層結(jié)構(gòu)較整齊，新生血管管腔稀疏，炎性細(xì)胞浸潤；C組、E組可見角膜上皮層變薄，基質(zhì)層炎性細(xì)胞浸潤，伴有大量毛細(xì)血管。堿燒傷后第14天，A組、B組、D組角膜上皮細(xì)胞均較完整，上皮層及基質(zhì)層水腫消退，基質(zhì)層見新生血管管腔，其中A組管腔較小，炎性細(xì)胞較前減少明顯，C組、E組仍可見上皮及基質(zhì)層的水腫及炎性細(xì)胞浸潤(圖4)。

圖2 堿燒傷后第14天，以裂隙燈顯微鏡觀察大鼠堿燒傷后角膜Figure 2 On the 14th day after alkali burn,the corneas of rats were observed by slit-lamp microscope

圖3 第3，7，14天各組CNV面積在角膜面積中的占比(C/N)的比較Figure 3 Histogram of CNV area in corneal area (C/N) in each group on the 3rd,7th and 14th day

表1 應(yīng)用方差分析比較各組CNV面積在角膜面積中的占比(n=6)Table 1 Analysis of variance was used to compare the proportion of CNV area in corneal area (n=6)

圖4 第14天，各組角膜組織HE染色(×200)Figure 4 HE staining of corneal tissue in each group on the 14th day (×200)

2.4 免疫組織化學(xué)檢測VEGFR-2與CD31蛋白的表達(dá)

正常大鼠角膜無新生血管，CD31蛋白不表達(dá)，VEGFR-2在上皮層角膜扁平上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞呈弱陽性。角膜堿燒傷后第14天，各組角膜VEGFR-2和CD31蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與A組、B組、D組比較，C組、E組CNV旺盛更為致密，呈現(xiàn)深綠色染色的CD31和VEGF蛋白表達(dá)較強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，VEGFR-2蛋白主要見于角膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)；在表達(dá)較弱的三組里，A組的CNV最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CD31和VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，B組和D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表2，圖5，圖6)。

圖5 角膜堿燒傷后第14天，各組角膜VEGFR-2與CD31蛋白表達(dá)Figure 5 Expression of VEGFR-2 and CD31 proteins in rat cornea in each group on the 14th day after alkali burn

表2 第14天，各組VEGFR-2和CD31免疫熒光IOD值(n=6)Table 2 Fluorescence IOD of VEGFR-2 and CD31 in each group on the 14th day (n=6)

圖6 第14天各組VEGFR-2蛋白和CD31蛋白表達(dá)比較Figure 6 Expression of VEGFR-2 and CD31 protein in each group on the 14th day

3 討論

病理性CNV與感染或化學(xué)灼傷引起的炎癥有關(guān)[10]。角膜堿燒傷可導(dǎo)致破壞性并發(fā)癥[11]，是造成大面積CNV形成的重要原因。CNV的形成與VEGF的過度表達(dá)密切相關(guān)[12]。盡管血管生長可以修復(fù)其部分影響，但CNV和高通透性可能導(dǎo)致視力受損和移植失敗[13]。前期的研究[14]發(fā)現(xiàn)：用貝伐單抗進(jìn)行結(jié)膜下注射或直接滴眼，能在一定程度上減少CNV的形成。本研究所選取的Nintedanib是新一代VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑。VEGFR的酪氨酸激酶是VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起點(diǎn)，受體介導(dǎo)而被激活，阻斷該位點(diǎn)可以有效抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成作用[9]。VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑可以抑制血小板源生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)和血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)。由于其損傷修復(fù)機(jī)制中能靶向作用于生長因子受體，臨床上已將其應(yīng)用于癌癥及肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的治療中[15-16]。最新的關(guān)于VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑[阿帕替尼(apatinib)]對CNV作用的研究[17]顯示：結(jié)膜下注射以納米顆粒為載體的apatinib(Apa-HSAPEG)可以有效地控制堿化學(xué)燒傷后CNV的生長。但定期結(jié)膜下注射對患者結(jié)膜的刺激性較大，同時增加了患者的就醫(yī)負(fù)擔(dān)。因此，在臨床上使用更便捷、損傷更小的滴眼液是否能達(dá)到更好的效果尚未可知。

本研究結(jié)果顯示：在使用不同濃度的Nintedanib后，動物模型的CNV出現(xiàn)不同程度的抑制。取制模后第3，7，14天3個時間點(diǎn)對CNV面積在角膜面積的占比(C/N)進(jìn)行測量，在第3天時，除C組外，其余三組的C/N較對照組有減少，A組、B組的C/N均較對照組有明顯減少，C組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在第7，14天時，各干預(yù)組C/N均小于對照組，其中A組的效果最好，B組和D組效果次之，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明Nintedanib溶液隨著濃度的升高，尤其是在第7天后CNV的面積出現(xiàn)了減少的趨勢，其抗新生血管生成的作用逐漸增強(qiáng)。同時，觀察第3，7，14天的炎性細(xì)發(fā)現(xiàn)，制模后第7，14天3個治療組的炎性細(xì)胞密度降低，表明Nintedanib對炎性細(xì)胞有一定的抑制作用。本研究結(jié)果表明：堿燒傷后的CNV生長是一個多因素共同作用的結(jié)果，而VEGF僅是其中重要的一環(huán)。不同濃度的Nintedanib對其他炎性因子和細(xì)胞通路的影響，還需進(jìn)一步的研究。

VEGFR-2是內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)VEGF信號的功能性受體，與血管生成密切相關(guān)，其特異性地表達(dá)于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后VEGFR發(fā)生自磷酸化，繼而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移行、出芽、血管滲漏和新生血管的形成[18]。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有CD31蛋白的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物，其表達(dá)水平與新生血管的生成相關(guān)[19-20]。因此，本研究中使用VEGFR-2和CD31蛋白作為評估CNV的標(biāo)志物。在本研究中，角膜堿燒傷后第14天，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)各組角膜VEGFR-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而與A組、B組和D組比較，C組、E組VEGFR-2蛋白陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，這證明Nintedanib能夠通過抑制VEGF的表達(dá)來抑制CNV；同時A組中VEGFR-2和CD31蛋白的表達(dá)量均最低，B組與D組的效果相當(dāng)，說明0.2%濃度的Nintedanib滴眼液抗CNV效果優(yōu)于0.1%地塞米松和0.05% Nintedanib，而0.02%Nintedanib幾乎沒什么效果。

本研究使用了Nintedanib局部滴眼的方法，通過觀察其發(fā)生發(fā)展情況及角膜內(nèi)VEGFR-2和CD31蛋白的表達(dá)情況，觀察CNV與VEGFR-2和CD31蛋白表達(dá)的時空一致性，結(jié)果證實Nintedanib可以減少堿燒傷引起的CNV，降低VEGFR-2和CD31蛋白的表達(dá)及炎癥因子水平，其中0.2% Nintedanib滴眼液的效果最好，為新藥研發(fā)及臨床防治堿燒傷引起的CNV治療提供了新的思路。