程 玉，郝美玲，薛 晶，齊潔敏

1.承德醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北 承德 067000；3.承德醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 承德 067000

胃癌是全球第4大常見癌癥，每年將近100萬(wàn)人被診斷為胃癌，約78.3萬(wàn)人死于胃癌［1］。中國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家之一，發(fā)病率和死亡率均居第2位［2］。癌細(xì)胞的無(wú)限增殖是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，闡明胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制對(duì)胃癌的防治具有重要意義。晝夜節(jié)律因子組成轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路（transcription-translation feedback loop，TTFL）產(chǎn)生晝夜節(jié)律，通過(guò)晝夜節(jié)律調(diào)控機(jī)體的各種生理功能［3］。BMAL1屬于bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，位于TTFL的核心部位，它能調(diào)控晝夜節(jié)律從而維持細(xì)胞和組織的生命活動(dòng)［4］。最近多項(xiàng)研究證實(shí)，BMAL1在結(jié)直腸癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中起到抑癌作用［5-6］。但關(guān)于BMAL1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為的影響及下游信號(hào)通路的研究較少。因此，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討B(tài)MAL1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能的分子機(jī)制，以期為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制及分子靶點(diǎn)治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系MGC-803購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自澳大利亞Clark公司，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，si-BMAL1和siRNA control由美國(guó)GE公司設(shè)計(jì)合成；抗BMAL1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗SHH、SMO、GLI1、Cyclin D1抗體及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海天能科技有限公司；MTT試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SHH信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺購(gòu)自美國(guó)MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

轉(zhuǎn)染前24 h內(nèi)將MGC-803細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將6孔板內(nèi)培養(yǎng)基換成不含血清的MEM，用LipofectamineTM3000試劑將si-BMAL1及亂序陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，6 h后換成含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

轉(zhuǎn)染48 h后，6孔板自溫箱內(nèi)取出，1×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗3遍，每次5 min。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞至1.5 mL Eppendorf試管內(nèi)，在4 ℃下以3 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，將沉淀內(nèi)水分吸盡，加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min后吸取上清液，考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，加入6×上樣緩沖液配樣后，在沸水中5 min變性。配制10%分離膠和5%濃縮膠，每個(gè)泳道中加入18 μL變性的蛋白樣品，以80 V的低壓在濃縮膠中進(jìn)行電泳，以120 V的電壓在分離膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，100 V 1.5 h轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后把聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放在用TTBS稀釋的5%脫脂奶粉中，室溫?fù)u床封閉2 h。加入按說(shuō)明書濃度稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱內(nèi)緩慢搖晃過(guò)夜，TTBS洗滌3次×10 min之后，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫溫育2 h，TTBS洗滌3次×10 min，電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑盒進(jìn)行顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，以GAPDH為內(nèi)參照，Image J軟件分析灰度值。

1.2.3 MTT法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將各組細(xì)胞按2 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到5個(gè)96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，每孔加入100 μL 10%MTT，將孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育4 h，棄掉上清液，每孔中加入100 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室溫?fù)u床10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（D）值。第3天給96孔板換液。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 平板集落形成實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將各組細(xì)胞分別按500、800、1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔板中，加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基混勻，每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)10 d左右，肉眼觀察到細(xì)胞集落形成時(shí)，去除培養(yǎng)基，1×PBS洗3次，每次5 min，冰甲醇固定15 min，1×PBS洗3次，每次5 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，流水緩慢沖洗掉染液，自然晾干后拍照，用Image J軟件計(jì)算集落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMAL1 si-RNA下調(diào)胃癌MGC-803細(xì)胞中BMAL1的表達(dá)

與陰性對(duì)照（negative control，NC）組（0.817±0.076）相比，轉(zhuǎn)染si-BMAL1后，MGC-803細(xì)胞中BMAL1蛋白的表達(dá)水平（0.217±0.104）明顯降低（P＜0.05），相對(duì)于陰性對(duì)照組，沉默效率為73.47%（圖1），說(shuō)明成功構(gòu)建了下調(diào)BMAL1表達(dá)的胃癌MGC-803細(xì)胞株。

圖1 si-BMAL1對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中BMAL1表達(dá)的影響Fig.1 The effect of si-BMAL1 transfection on BMAL1 expression in the MGC-803 cells

2.2 敲減BMAL1基因上調(diào)胃癌MGC-803細(xì)胞活力

MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估胃癌細(xì)胞體外增殖能力，與NC組相比，si-BMAL1組在第3、4、5天的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，D值分別為0.236±0.004、0.343±0.050、0.488±0.036（P＜0.05，圖2）。與NC組（65.000±10.000）相比，si-BMAL1組（155.667±11.015）的細(xì)胞集落形成數(shù)明顯增多（P＜0.05，圖3）。MTT實(shí)驗(yàn)及集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示敲減BMAL1基因促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

圖2 BMAL1基因敲減對(duì)各組MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 The effect of BMAL1 gene knockdown on growth curve of MGC-803 cells in different groups

圖3 BMAL1基因敲減對(duì)各組MGC-803細(xì)胞集落形成的影響Fig.3 The effect of BMAL1 gene knockdown on colony formation of MGC-803 cells in different groups

2.3 敲減BMAL1后胃癌MGC-803細(xì)胞中cyclin D1蛋白水平升高，并促進(jìn)SHH信號(hào)通路激活

與NC組（0.540±0.072、0.447±0.703、0.400±0.050、0.300±0.050）相比，si-BMAL1組中cyclin D1蛋白水平（1.200±0.100）明顯升高，SHH通路關(guān)鍵激活因子SHH（0.830±0.070）、SMO（0.743±0.050）、GLI1（0.700±0.050）表達(dá)水平也升高（P＜0.05，圖4），說(shuō)明下調(diào)BMAL1表達(dá)可以明顯促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞中SHH信號(hào)通路的激活。

圖4 敲減BMAL1基因?qū)GC-803細(xì)胞中cyclin D1、SHH、SMO和GLI1蛋白水平的影響Fig.4 The effects of BMAL1 gene knockdown on the protein levels of cyclin D1,SHH,SMO and GLI1 in MGC-803 cells

2.4 SHH信號(hào)通路特異性抑制劑對(duì)si-BMAL1的胃癌MGC-803細(xì)胞活力的影響

SHH信號(hào)通路特異性激活劑環(huán)巴胺處理si-BMAL1的胃癌MGC-803細(xì)胞，si-BMAL1組細(xì)胞形成集落數(shù)為82.333±4.933，si-BMAL1+環(huán)巴胺組細(xì)胞形成集落數(shù)為91.667±7.024，敲減BMAL1帶來(lái)的胃癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目增多的情況有所恢復(fù)（圖5）。

2.5 抑制SHH信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)下調(diào)BMAL1對(duì)細(xì)胞中cyclin D1、SHH、SMO和GLI1蛋白水平的影響

與si-BMAL1組（1.140±0.125、0.853±0.110、0.770±0.111、0.700±0.100）相比，si-BMAL1+環(huán)巴胺組細(xì)胞中的cyclin D1蛋白水平（0.937±0.061）并未出現(xiàn)之前上調(diào)的變化，SHH（0.473±0.097）、SMO（0.407±0.040）和GLI1（0.343±0.067）蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖6）。

圖5 抑制SHH信號(hào)通路對(duì)敲減BMAL1基因誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The effects of inhibition of SHH signaling pathway on BMAL1 gene knockdown-induced proliferation of the gastric cancer cells

圖6 抑制SHH信號(hào)通路對(duì)敲減BMAL1基因表達(dá)的MGC-803細(xì)胞中cyclin D1、SHH、SMO和GLI1蛋白水平的影響Fig.6 The effects of SHH signaling pathway inhibition on the protein levels of cyclin D1,SHH,SMO and GLI1 in the gastric cancer cells with BMAL1 gene knockdown

3 討 論

腫瘤細(xì)胞失控性生長(zhǎng)是惡性腫瘤最基本的特征，侵襲、轉(zhuǎn)移等其他生物學(xué)行為也是建立在此基礎(chǔ)之上，因此關(guān)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的研究一直是一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。大量基因表達(dá)微陣列研究表明，晝夜節(jié)律基因與細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖和凋亡有關(guān)［7］，但是具體的調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。晝夜節(jié)律由一系列的生物節(jié)律因子調(diào)控，其中BMAL1是組成節(jié)律基因負(fù)反饋環(huán)路的核心元件，對(duì)于維持機(jī)體正常晝夜節(jié)律極其重要。BMAL1定位于11號(hào)染色體短臂，屬于bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域蛋白家族，而BMAL1調(diào)控其他生物鐘基因轉(zhuǎn)錄起始，激活哺乳動(dòng)物生物鐘基因的表達(dá)，包括BMAL1在內(nèi)的這些生物鐘基因在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［8］。

多項(xiàng)研究證實(shí)，BMAL1的異常表達(dá)可能參與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為［5-6］。BMAL1在舌鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)、生物周期節(jié)律重置，主要表現(xiàn)為周期縮短、振幅明顯降低，提示生物鐘基因表達(dá)異常以及生物節(jié)律紊亂與舌鱗狀細(xì)胞癌緊密相關(guān)［6］。節(jié)律因子的表達(dá)異常及節(jié)律改變勢(shì)必會(huì)打破細(xì)胞周期的平衡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的大量、無(wú)限增殖。目前關(guān)于節(jié)律因子BMAL1在腫瘤中的作用多表現(xiàn)出抑癌作用，He等［9］報(bào)道與遠(yuǎn)處正常和慢性炎癥組織相比，鼻咽癌組織標(biāo)本中BMAL1的表達(dá)降低，BMAL1在中國(guó)鼻咽癌患者中表達(dá)的降低與患者的總生存期短有關(guān)，提示BMAL1可能是鼻咽癌中的抑癌蛋白。Qiu等［10］結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)及多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析14種節(jié)律基因在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BMAL1在肺癌組織中通常呈低表達(dá)，而BMAL1高表達(dá)的患者生存期更長(zhǎng)，也就是說(shuō)BMAL1在非小細(xì)胞肺癌中也扮演著抑癌基因的角色。本研究集中探討了生物節(jié)律因子BMAL1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響及可能的下游信號(hào)通路。通過(guò)MTT法及集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲減BMAL1基因可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，也就是說(shuō)BMAL1抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與魏柏等［11］的研究結(jié)果一致，但具體的作用機(jī)制尚不明確。

最近有研究報(bào)道，在小鼠肝脂肪變性模型中，體內(nèi)肝臟及體外肝細(xì)胞中Hh信號(hào)通路都表現(xiàn)出晝夜節(jié)律變化，并且敲低BMAL1表達(dá)后，IHH及GLI1蛋白水平上調(diào)［12］。晝夜節(jié)律與IHH信號(hào)通路的交互對(duì)話提示我們BMAL1可能是通過(guò)SHH信號(hào)通路從而影響胃癌細(xì)胞的增殖。于是我們?cè)谇脺pBMAL1基因的表達(dá)后檢測(cè)SHH信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白SHH、SMO及GLI1的表達(dá)，結(jié)果SHH、SMO及GLI1表達(dá)均上調(diào)，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的猜想，我們又在干擾BMAL1之后加入SHH通路抑制劑環(huán)巴胺，發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺能下調(diào)SHH、SMO及GLI1的表達(dá)，之前干擾BMAL1之后促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的現(xiàn)象有所恢復(fù)，提示BMAL1確實(shí)是通過(guò)SHH信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖。在典型通路中，哺乳動(dòng)物中Hh配體有SHH、IHH和DHH 3種類型，該通路由兩個(gè)受體組成，一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子PTCH和一個(gè)正調(diào)節(jié)因子SMO，Hh與PTCH1的結(jié)合抑制了SMO，導(dǎo)致SMO在纖毛中積累并在細(xì)胞質(zhì)末端磷酸化，這一過(guò)程介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GLI1、GLI2、GLI3）通過(guò)SMO被激活進(jìn)入細(xì)胞核中，與啟動(dòng)子的靶DNA序列結(jié)合，表達(dá)特定的基因，如編碼c-MYC、BCL2和SNAIL基因［13］。SHH基因定位于7q36染色體上，是人類3種Hedgehog同源基因中最為重要、研究最為廣泛的一種，在人類的多種組織和器官中廣泛存在［14］。SHH通路參與胚胎發(fā)生、組織分化、自我更新、體內(nèi)平衡和成體干細(xì)胞增殖，尤其在消化系統(tǒng)中作用更為明顯［15］。除維持正常生理功能外，SHH信號(hào)通路在多種惡性腫瘤組織中異常激活，其參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，抑制SHH信號(hào)通路可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［16］。

綜上，敲減BMAL1基因表達(dá)可以通過(guò)抑制SHH信號(hào)通路的激活促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。本研究闡明了BMAL1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用及下游的信號(hào)通路，為明確胃癌的發(fā)病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。