徐珊珊，宋琴琴，仵紅嬌，付 寧，車(chē)玲玉，金 敏，劉 沖，韓素桂，張雪梅，張 志

1.華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；3.華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河北 唐山 063000

中國(guó)是癌癥高發(fā)國(guó)家，全球約22%的新發(fā)癌癥病例出現(xiàn)在中國(guó)，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率居全國(guó)第4位，嚴(yán)重威脅居民健康［1］。HCC可歸因于生活方式與環(huán)境致癌因素和遺傳因素之間復(fù)雜的相互作用［2］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）通過(guò)改變基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)量影響基因?qū)C(jī)體的調(diào)控，目前已確認(rèn)SNP與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［3-4］。深入研究HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)于HCC防控具有重要意義。膜輔助蛋白CD46通過(guò)血清因子Ⅰ使補(bǔ)體成分C3b和C4b裂解失活，保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，HCC HBx通過(guò)激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)CD46致HCC細(xì)胞免于CDC，表明CD46可能作為HCC患者的潛在分子標(biāo)志物。Bresin等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CD46基因多態(tài)性與非典型溶血性尿毒癥綜合征有關(guān)。目前關(guān)于CD46基因啟動(dòng)子區(qū)遺傳變異與惡性腫瘤易感性關(guān)聯(lián)的研究甚少，因此本研究探討CD46基因多態(tài)性對(duì)HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，為HCC的早期篩查及免疫治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）在線網(wǎng)站是一腫瘤表達(dá)譜數(shù)據(jù)的交互式web服務(wù)器，能提供腫瘤和正常組織的差異表達(dá)分析及生存分析等多種分析模塊，包含33種癌癥類(lèi)型的9 736個(gè)腫瘤組織樣本和8 587個(gè)正常組織樣本［8］。利用GEPIA對(duì)CD46在HCC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2 研究對(duì)象

選取2011—2015年在華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院和華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查確診且未經(jīng)放化療的HCC患者240例作為病例組，對(duì)照組為同時(shí)期入院體檢的健康人群500名。所有研究對(duì)象均無(wú)血緣關(guān)系。以查閱病歷資料和問(wèn)卷調(diào)查的方法收集研究對(duì)象一般人口學(xué)資料及臨床資料，全部研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。本研究獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20190321）。

1.3 SNP位點(diǎn)選擇

通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中CD46基因啟動(dòng)子區(qū)SNP進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出影響基因轉(zhuǎn)錄翻譯功能區(qū)域內(nèi)的SNP，且所篩選的SNP在中國(guó)人群次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于0.05。最終篩選出的CD46 rs1970530遺傳變異可影響CD46轉(zhuǎn)錄活性。

1.4 DNA提取和基因分型

收集研究對(duì)象的外周靜脈血2 m L，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的DNA提取試劑盒（DP318）提取DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法進(jìn)行CD46 rs1970530 A＞G基因分型。上游引物為5’-TTCTATGAACAAACAGCCCT-3’，下游引物為5’-TCTGGCAGTTACCTTTGTGTG-3’。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸3 min。得到341 bp的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物在10 μL體系中進(jìn)行酶切，置于65 ℃水浴過(guò)夜。采用2%的瓊脂凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物分析，根據(jù)片段大小進(jìn)行基因分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中所有變量均采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組中性別、年齡和吸煙狀況的分布差異。由于對(duì)照組年齡中位數(shù)為60歲，故以60歲為界分為兩組。采用非條件logistic回歸模型分析以O(shè)R及其95% CI來(lái)表示CD46 rs1970530變異與HCC發(fā)病相對(duì)危險(xiǎn)度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD46在HCC組織中表達(dá)顯著上調(diào)

應(yīng)用GEPIA工具對(duì)CD46在HCC組織（369例）和癌旁組織（50例）中的表達(dá)進(jìn)行差異分析，CD46在HCC組織中的表達(dá)較正常組織顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 基線臨床資料

選取入組的基線臨床資料見(jiàn)表1。HCC組共納入240例患者，男性188例，女性52例，高年齡組（＞60歲）102例，低年齡組（≤60歲）138例；對(duì)照組共納入500名健康體檢者，男性374例，女性126例，高年齡組（＞60歲）220例，低年齡組（≤60歲）280例。結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組中年齡、性別及吸煙狀況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.3 CD46 rs1970530遺傳變異與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

圖1 CD46在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC組織及對(duì)照組織中的差異表達(dá)Fig.1 The levels of CD46 in HCC and control tissues from GEPIA database were shown in the box plot image

CD46 rs1970530基因型在HCC組及對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具有群體代表性。結(jié)果顯示，CD46 rs1970530 A＞G多態(tài)性分布與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。以AA基因型為參照，至少攜帶一個(gè)G等位基因者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR=0.666，95% CI：0.448～0.990，P＜0.05）；以A等位基因?yàn)閰⒄?，攜帶G等位基因者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR=0.689，95% CI：0.478～0.994，P＜0.05，表2）。

表1 研究對(duì)象的基本人口學(xué)特征Tab.1 Basic demographic characteristics of the study subjects

表2 基因型分布和等位基因頻率分布及顯性模式下對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)Tab.2 Genotype distribution and allele frequency distribution and prediction of risk of onset in dominant mode

2.4 CD46 rs1970530 A＞G遺傳變異與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

分層結(jié)果見(jiàn)表3，按年齡分層分析，高年齡組（＞60歲）中，CD46 rs1970530與HCC易感性有顯著關(guān)聯(lián)，至少攜帶一個(gè)G等位基因者較AA基因型攜帶者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR=0.789，95% CI：0.298～0.995，P＜0.05）。經(jīng)性別分層分析后，至少攜帶一個(gè)G等位基因者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)低于AA基因型攜帶者（OR=0.596，95% CI：0.381～0.931，P＜0.05）。在女性、低年齡組（≤60歲）中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。吸煙狀態(tài)分層結(jié)果未發(fā)現(xiàn)CD46 rs1970530變異與HCC易感性有明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

表3 CD46 rs1970530A＞G與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析Tab.3 Stratification analysis of CD46 rs1970530A＞G and the risk of HCC

3 討 論

膜結(jié)合型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（membrane-bound complement regulatory protein，mCRP）是在補(bǔ)體系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的一種負(fù)反饋因子，其作用在于避免補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活。CD46作為mCRP家族中的重要一員，其高表達(dá)可抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)測(cè)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，也可通過(guò)直接抑制γδ T細(xì)胞分泌的干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，T N F-α），形成有利于腫瘤的微環(huán)境［9-10］。過(guò)表達(dá)的CD46已被證實(shí)與人類(lèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，包括乳腺癌、結(jié)腸癌和多發(fā)性骨髓瘤等［11-13］。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出，在HCC組織中CD46表達(dá)上調(diào)，這與之前Lu等［14］的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)CD46在HCC患者血清中表達(dá)增加，表明CD46的異常表達(dá)可能在HCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用?？紤]到CD46在HCC中發(fā)揮的功能，我們測(cè)定CD46 rs1970530在HCC組及對(duì)照組中的基因型，結(jié)果顯示，CD46 rs1970530基因分布與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，至少攜帶一個(gè)G等位基因者患HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，目前尚未見(jiàn)其他CD46 rs1970530與惡性腫瘤易感性的研究報(bào)道。本課題組通過(guò)分析軟件TRANSFAC預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD46 rs1970530A＞G多態(tài)性影響轉(zhuǎn)錄因子Oct-1、NF-1、MCM1、SRF及Sp1的結(jié)合，我們推測(cè)CD46 SNP影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合上調(diào)CD46的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。經(jīng)性別分層分析后，發(fā)現(xiàn)至少攜帶一個(gè)G等位基因者與男性HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而與女性HCC無(wú)關(guān)，這種性別差異可能是體脂成分及性激素水平不同所引起［15］。在年齡分層分析中，至少攜帶一個(gè)G等位基因者在高年齡組與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示高齡和CD46 rs1970530變異可能共同影響HCC的易感性。一項(xiàng)Meta分析［16］顯示，吸煙者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)是非吸煙者的1.6倍，但本研究并未發(fā)現(xiàn)吸煙與CD46 rs1970530遺傳變異的關(guān)系，可能與所選研究對(duì)象的樣本量較小有關(guān)。

另外，還有一些基因遺傳變異與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶rs2494752 GG基因型的個(gè)體HCC患病風(fēng)險(xiǎn)增加。高慧等［18］研究發(fā)現(xiàn)，TNFSF15-358T＞C遺傳變異影響HCC易感性，CC基因型攜帶者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加。攜帶rs12979860 T/C的個(gè)體，肝炎病毒相關(guān)HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高［19］。

綜上所述，CD46 rs1970530遺傳變異與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，該位點(diǎn)有望成為判斷HCC易感性的生物標(biāo)志物，從而為臨床提供更多潛在預(yù)防及治療策略。