河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，河北 石家莊 050011

在中國(guó)，食管鱗癌占食管癌的90%，具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，5 年生存率低于20%［1］。因此，尋找具有高靈敏度和特異度的分子標(biāo)志物，對(duì)于食管癌早期診斷和治療效果評(píng)價(jià)具有重大意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程廣泛參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是EMT過(guò)程中最有效的刺激因子［2］，因而篩選TGF-β1處理后差異表達(dá)的基因，將為探究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后FAM83H的表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，可知FAM83H在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常，但在食管鱗癌中的表達(dá)及作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析FAM83H在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況及其表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，同時(shí)觀察在體外FAM83H對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞系

組織標(biāo)本取自2015—2017年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物樣本庫(kù)收集的食管鱗癌手術(shù)患者，共67例，其中男性48例，女性19例?；颊咝g(shù)前均未接受任何治療（化療和放療）。組織標(biāo)本包括食管鱗癌原發(fā)灶組織及距原發(fā)灶邊緣3～5 cm以上的相應(yīng)癌旁正常組織。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。食管鱗癌患者具體資料詳見(jiàn)表1。

食管正常上皮細(xì)胞HEEpiC購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。食管癌細(xì)胞系Kyse170、TE1、Kyse150和Eca109均由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理學(xué)研究室保留并傳代。TGF-β1對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109的處理培養(yǎng)方法：TGF-β1處理組用10 ng/mL的重組TGF-β1處理，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d；對(duì)照組用不含TGF-β1的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)7 d，其余條件完全相同。

1.2 主要試劑

si-FAM83H小干擾RNA由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司設(shè)計(jì)并合成；表達(dá)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；MTS試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 食管癌細(xì)胞系培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

所有食管癌細(xì)胞系置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞，消化并鋪至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌的Eppendorf試管，其中1個(gè)加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，吹吸混勻，另1個(gè)加入50 nmol/L siRNA及100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，室溫放置5 min，隨后，將上述2個(gè)Eppendorf試管中液體吹吸混勻，室溫溫育20 min。轉(zhuǎn)染24～48 h后收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后FAM83H的敲低效率，并進(jìn)行后續(xù)的研究。

表1 食管鱗癌患者的臨床病理學(xué)資料Tab.1 Clinicopathological characteristics of 67 ESCC patients

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)FAM83H在食管癌細(xì)胞系和食管鱗癌組織中的表達(dá)情況

按照RTFQ-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以GAPDH作為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。RTFQ-PCR引物序列見(jiàn)表2。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，可變溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM83H對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞密度，按照1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板上，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別在細(xì)胞貼壁后0、24、48、72和96 h向每孔中加入MTS試劑20 μL，培養(yǎng)箱中溫育1～3 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（D）值。

1.6 Transwell小室遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM83H對(duì)食管癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)：在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞密度，向上室中加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液（含1×105個(gè)細(xì)胞），向下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，將小室置于4%多聚甲醛溶液中固定后在結(jié)晶紫染液中染色，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)：首先在上室中加入50 μL稀釋好的Matrigel，確保Matrigel充分凝固進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)方法同transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間的比較在服從正態(tài)分布時(shí)，采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布時(shí)，差異比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析。以上均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 RTFQ-PCR引物Tab.2 Primer sequences of RTFQ-PCR

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1處理7 d后食管癌細(xì)胞Eca109的形態(tài)學(xué)變化

食管癌細(xì)胞Eca109經(jīng)過(guò)10 ng/mL TGF-β1處理7 d后，在顯微鏡下觀察Eca109變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭形、紡錘形，呈現(xiàn)出明顯的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

圖1 TGF-β1處理前后Eca109細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Cell morphology in TGF-β1 treated or untreated Eca109 cells

2.2 TGF-β1處理7 d后食管癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平變化

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，與TGF-β1未處理細(xì)胞相比，處理后細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平改變，其中E-cadherin［（0.44±0.05）vs（1.03±0.23），P＜0.05］表達(dá)量下調(diào)，而N-cadherin［（10.59±1.14）vs（1.11±0.17），P＜0.0 1］、vimentin［（1.3 9±0.0 6）v s（1.02±0.02），P＜0.01］、Snail［（3.62±0.22）v s（1.0 5±0.1 2），P＜0.0 1］和Twist1［（1.67±0.14）vs（0.95±0.08），P＜0.01］表達(dá)量均上調(diào)（圖2）。

2.3 TGF-β1處理7 d后FAM83H的表達(dá)水平變化

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，與TGF-β1未處理的細(xì)胞中FAM83H的相對(duì)表達(dá)量相比，TGF-β1處理后FAM83H的相對(duì)表達(dá)量顯著升高［（4.66±0.35）vs（1.06±0.12），P＜0.01，圖3］。

圖2 TGF-β1處理前后Eca109細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化Fig.2 Relative expression levels of EMT-related markers were detected in TGF-β1 treated or untreated Eca109 cells

圖3 TGF-β1處理前后Eca109細(xì)胞中FAM83H表達(dá)變化Fig.3 Relative expression level of FAM83H was assessed in TGF-β1 treated or untreated Eca109 cells

2.4 FAM83H在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)間的相關(guān)性

利用RTFQ-PCR檢測(cè)FAM83H在67例食管鱗癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H在食管鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織［1.05（0.50，2.31）vs0.59（0.27，1.72），Z=-2.53，P＜0.05］（圖4）。結(jié)合臨床病理學(xué)參數(shù)分析，F(xiàn)AM83H表達(dá)量在低分化組患者中顯著高于中、高分化組患者［3.58（1.39，6.91）vs1.18（0.74，3.44），Z=-2.39，P＜0.05］。按照年齡、性別、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組ESCC組織中FAM83H的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.5 FAM83H在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)

通過(guò)RTFQ-PCR計(jì)算在4株食管癌細(xì)胞Kyse170、TE1、Kyse150和Eca109中FAM83H的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果分別為4.1 7±0.4 7、11.35±1.54、13.80±1.60和3.37±0.23，均高于食管上皮細(xì)胞HEEpiC的相對(duì)表達(dá)量（0.98±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且在Kyse150細(xì)胞中的表達(dá)水平最高（圖5）。

圖4 FAM83H在食管鱗癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)水平Fig.4 Relative expression level of FAM83H in ESCC tissues and corresponding normal tissues

圖5 FAM83H在4株人食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.5 Relative expression level of FAM83H in four human esophageal cancer cell lines

2.6 轉(zhuǎn)染si-FAM83H后檢測(cè)FAM83H的敲低效率

在FAM83H中表達(dá)水平較高的Kyse150轉(zhuǎn)染si-FAM83H，采用RTFQ-PCR檢測(cè)FAM83H的相對(duì)表達(dá)量，與轉(zhuǎn)染si-NC組（0.92±0.10）相比，轉(zhuǎn)染si-FAM83H-1、si-FAM83H-2和si-FAM83H-3組FAM83H的相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.04、0.88±0.15和0.53±0.11。其中，si-FAM83H-1具有顯著的敲低效率（P＜0.01，圖6），用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.7 敲低FAM83H抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力

MTS實(shí) 驗(yàn) 結(jié)果 顯 示，si-FAM83H-1 組與對(duì)照組相比能顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力，并且在干擾48 h［（0.59±0.07）v s（0.8 3±0.0 5），P＜0.0 1］和7 2 h［（0.72±0.06）vs（1.05±0.10），P＜0.01］后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

2.8 敲低FAM83H抑制食管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力

Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-FAM83H-1組穿膜細(xì)胞數(shù)（329.00±36.13）顯著低于對(duì)照組（431.00±55.65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖8A）。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-FAM83H-1 組穿膜細(xì)胞數(shù)（382.00±46.0）顯著低于對(duì)照組（5 5 1.0 0±2 6.6 1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖8B），說(shuō)明敲低FAM83H能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖6 FAM83H敲低效率Fig.6 The interfering efficiency against FAM83H

圖7 敲低FAM83H抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力Fig.7 FAM83H knockdown inhibits proliferation ability of esophageal cancer cells

圖8 敲低FAM83H抑制食管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力Fig.8 FAM83H knockdown inhibits migration and invasion of esophageal cancer cells

3 討 論

腫瘤是一類(lèi)多因素參與、多步驟進(jìn)展的復(fù)雜性疾病。隨著對(duì)腫瘤分子機(jī)制深入的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中大多伴隨一些基因的異常表達(dá)，因此，篩選出腫瘤中特異性的異?；颍瑢槟[瘤的早診早治奠定理論基礎(chǔ)。

TGF-β信號(hào)通路在惡性腫瘤的EMT過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括經(jīng)典Smad及非經(jīng)典Smad信號(hào)通路［3-5］。本研究利用TGF-β1處理食管癌細(xì)胞Eca109，成功誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT。在顯微鏡下可以觀察到食管癌細(xì)胞由圓形、橢圓形變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭形、紡錘形，細(xì)胞變得離散，細(xì)胞間黏附消失，呈現(xiàn)出明顯的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平也發(fā)生改變，其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin以及轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail均表達(dá)上調(diào)。FAM83H在TGF-β1處理后的食管癌細(xì)胞中表達(dá)水平也上調(diào)，提示FAM83H有可能參與食管鱗癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

有研究表明，F(xiàn)AM83 家族是潛在的癌基因家族，F(xiàn)AM83 家族共有8 個(gè)成員，F(xiàn)AM83A～FAM83H。除FAM83G外，其余成員基因N端附近都有一段保守且功能未知的結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為DUF1669，這一結(jié)構(gòu)可能與該家族成員的致瘤性密切相關(guān)。目前大量研究［6-15］表明，在多種實(shí)體腫瘤中該家族成員基因表達(dá)上調(diào)，例如，F(xiàn)AM83A在肺腺癌中表達(dá)升高，與肺腺癌臨床分期及預(yù)后相關(guān)［6］；在胰腺癌中高表達(dá)，與胰腺癌患者總生存率、無(wú)病生存率顯著相關(guān)，發(fā)揮致癌作用［7］。FAM83B在食管鱗癌［8］、胃癌［9］中表達(dá)上調(diào)。FAM83D在肝癌［10］、結(jié)直腸癌［11］、卵巢癌［12］等腫瘤中表達(dá)上調(diào)。FAM83H在骨肉瘤、宮頸癌、肝癌等［13-15］惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，但是在食管鱗癌中尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)了67對(duì)食管鱗癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H在食管鱗癌組織中表達(dá)水平顯著升高，表明其在食管鱗癌中可能也發(fā)揮癌基因的作用。進(jìn)一步研究FAM83H對(duì)食管癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)FAM83H促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。在骨肉瘤中，F(xiàn)AM83H與β-catenin直接結(jié)合，并通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的β-catenin泛素化來(lái)調(diào)節(jié)β-catenin蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)骨肉瘤的增殖及侵襲［13］。在宮頸癌中，F(xiàn)AM83H激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲［14］。在肝癌中，MYC結(jié)合至FAM83H啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)FAM83H轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝癌組織中FAM83H表達(dá)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)cyclin-D1、cyclin-E1、snail和MMP2的表達(dá)，抑制P53和P27的表達(dá)［15］。

綜上所述，F(xiàn)AM83H在TGF-β1處理后的食管癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。同時(shí)FAM83H在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平升高，并且其表達(dá)水平與病理學(xué)分化程度相關(guān)，在體外促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。對(duì)于FAM83H是如何促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮促癌作用，還需要進(jìn)一步的機(jī)制研究。