張 欣，周 成，周愷乾，柏乾明，蔣冬先，宿杰阿克蘇，侯英勇，王 征，紀 元

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032；3.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

肉瘤樣肝細胞癌（sarcomatoid hepatocellular carcinoma，SHC）是一種罕見的、伴有肉瘤樣（梭形細胞或巨細胞）分化的肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］，常見于化療后的患者［2］。SHC惡性程度高，預后差，傳統外科手術治療效果不佳［3］。

MET是原癌基因MET編碼的蛋白，為肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）受體，具有酪氨酸激酶活性，在正常細胞和腫瘤細胞中均有表達。MET持續(xù)激活是細胞癌變及癌細胞增殖亢進的重要原因。多項研究［4-8］表明，MET蛋白過表達和基因擴增存在于非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌及HCC等多種腫瘤的發(fā)生和轉移過程中，并與這些腫瘤的預后密切相關。以MET為靶點的酪氨酸激酶抑制劑已成為晚期腫瘤靶向治療的重要方向［9-10］。然而，SHC中MET基因擴增狀態(tài)尚不明確。

本研究回顧性分析SHC患者的臨床病理學資料，采用熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）法檢測SHC中MET基因擴增狀態(tài)，并探討MET基因擴增與SHC患者臨床病理學特征及預后的關系，旨在為判斷SHC患者的預后引進新的指標，也為SHC的靶向藥物治療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

從2008年1月—2016年12月就診于復旦大學附屬中山醫(yī)院并行肝癌手術切除的15 000例患者中，篩選出原發(fā)性SHC 22例，所有切片均由2名高年資消化病理科醫(yī)師復核。診斷標準參照2010、2019年修訂的世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）消化系統腫瘤［1，11］分類：SHC是一種伴有明顯肉瘤樣結構的HCC，多數含有典型的HCC區(qū)域，或免疫組織化學染色和臨床病史提示為肝細胞來源。收集患者臨床信息，包括性別、年齡、既往史等，采用電話隨訪結合患者來院復查進行病例隨訪，隨訪截至2019年4月。

1.2 免疫組織化學檢測

所有手術切除標本均經37%的甲醛溶液固定24 h以上，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，H-E染色及免疫組織化學染色。所用一抗細胞角蛋白（CKpan）、結蛋白（desmin）、精氨酸酶-1（arginase-1，ARG1）均購自丹麥Dako公司。

1.3 FISH檢測

應用M E T基因擴增檢測試劑盒（探針D7S522，美國Abbott Vysis公司）。具體步驟如下：經常規(guī)烤片、脫蠟后，88～92 ℃下應用純水預處理組織切片30 min，37 ℃下應用胃蛋白酶消化15～20 min，漂洗、固定、脫水。待組織切片自然干燥后，將探針工作液10 μL滴加于組織標本上，用橡膠水泥封邊。將組織切片置于雜交儀中，78 ℃變性5 min后，42 ℃雜交12～18 h。經雜交后洗滌、干燥，加入10 μL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，室溫下放置15 min，于熒光顯微鏡下觀察結果，最后將FISH熒光切片放在-20 ℃下避光長期保存。采用FISH法檢測MET基因擴增的判讀標準參照參考文獻［12］。計算至少40個腫瘤細胞，若腫瘤細胞中MET基因平均拷貝數≥5.0個和（或）MET/CEP7比值≥2.0時，診斷為MET基因擴增；否則視為陰性。

1.4 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行數據處理及統計學分析，MET基因擴增與臨床病理學因素的相關性采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier模型、logrank檢驗和單因素分析。多因素預后分析采用COX回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

22例SHC患者中，男性18例，女性4例。年齡35～75歲，中位年齡57.5歲。自覺右上腹脹痛者9例，以低熱為主要癥狀者1例，癥狀持續(xù)時間2～6周不等，體檢發(fā)現肝占位而無臨床癥狀者12例。4例非首次就診患者，其中術前接受過經導管動脈化療栓塞術3例，射頻消融術1例。腫瘤絕大多數位于肝右葉（17例），少部分位于肝左葉（4例）與肝中葉（1例）。22例患者中11例行腫塊所在肝葉切除術，另11例行特殊肝段切除術；13例術后輔以放療和化療。實驗室檢查：22例SHC患者中，乙肝病毒表面抗原陽性者16例，血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）升高者13例，丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶或γ-谷氨酰轉移酶等肝功能指標異常者17例。根據巴塞羅那臨床肝癌分期（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）系統分類：10例患者為A期，7例患者為B期，5例患者為C期。根據2019版中國肝癌分期（China Liver Cancer Staging，CNLC）方案，Ⅰ期患者11例，Ⅱ期5例，Ⅲ期5例，Ⅳ期1例。

2.2 病理學特征

腫塊直徑為2.2～15.0 cm，平均7.2 cm，其中8例最大徑在10.0 cm以上。腫瘤切面灰白灰黃，常伴出血（5例）及壞死（12例）。6例患者存在2個及以上多發(fā)病灶。22例SHC均存在惡性梭形細胞成分，其中梭形細胞成分中具有上皮細胞標志物表達者16例，無上皮細胞標志物表達者6例（圖1A）。部分梭形細胞顯著異型，可見瘤巨細胞，類似多形性未分化肉瘤樣形態(tài)（圖1B）；部分梭形細胞較一致，核分裂象易見，類似纖維肉瘤樣形態(tài)（圖1C）；部分肉瘤區(qū)域內可見成熟骨小梁結構，呈現骨樣分化（圖1D）；部分肉瘤樣細胞核略偏位（圖1E），免疫組織化學檢查示desmin陽性（圖1F），提示橫紋肌分化。所有病例中具有經典HCC組織學形態(tài)者15例（圖1G），腫瘤細胞排列呈細梁狀、假腺樣或粗梁狀；呈低分化癌形態(tài)者2例（圖1H），免疫組織化學檢查顯示ARG1陽性（圖1I），提示肝細胞來源。全部由肉瘤樣梭形細胞組成者5例，該5例患者均具有慢性乙型肝炎病史及結節(jié)性肝硬化，同時伴有血清AFP升高，其中1例術前接受過射頻消融治療。

2.3 MET基因擴增與臨床病理學特征的關系

用FISH法對22例SHC患者標本進行了MET基因擴增檢測，5例檢測出MET基因擴增，陽性率為22.7%。其中，2例腫瘤細胞內MET基因平均拷貝數≥5.0個，且MET/CEP7比值≥2.0；另外3例腫瘤細胞內MET基因平均拷貝數≥5.0個，而MET/CEP7比值＜2.0。4例MET基因擴增信號存在異質性，分化差的肉瘤樣區(qū)域（圖1A）呈MET基因擴增陽性（圖2A），而同一病例中經典HCC區(qū)域（圖1G）呈MET基因擴增陰性（圖2B）。MET基因擴增與患者的性別、年齡、肝功能、血清AFP水平、腫塊部位、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤包膜、肝外轉移、微脈管癌栓及腫瘤分期（包括BCLC和CNLC）均無相關性（P＞0.05，表1）。

2.4 MET基因擴增與預后的關系

對本組所有患者均進行隨訪，中位隨訪時間為20.7個月（1.4～55.3個月），中位總生存期（overall survival，OS）和中位無病生存期（disease-free survival，DFS）分別為23.4和7.2個月。15例出現疾病進展，12例死亡?；颊逴S和DFS與患者性別、年齡、肝功能、血清AFP、腫塊部位、腫瘤大小、肝外轉移、微脈管癌栓及BCLC等單因素分析無相關性（P＞0.05，表2）。經Kaplan-Meier生存分析顯示，MET基因擴增陽性的患者中位OS為6.8個月，明顯低于MET基因擴增陰性患者的24個月，log-rank時序檢驗顯示差異有統計學意義（P=0.001，圖3，表2）。具有完整腫瘤包膜患者的中位OS明顯高于包膜不完整患者（41.3個月vs8.5個月，P=0.001，圖3，表2）。單灶腫瘤及CNLC Ⅰ期患者的中位DFS較多灶腫瘤及Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期患者明顯延長（10.4個月vs3.8個月，12.4個月vs3.8個月，P=0.027和0.017，圖3，表2）。COX回歸模型多因素分析顯示，MET基因擴增是影響生存的獨立預后因素，FISH檢測MET基因表達結果呈陽性的患者預后差（表3）。

圖1 SHC病理學形態(tài)Fig.1 Pathological features of SHC

圖2 FISH法檢測SHC組織中MET基因擴增狀態(tài)Fig.2 MET gene amplification in SHC tissues detected by FISH

表1 SHC中MET基因擴增與臨床病理特征的關系Tab.1 The correlation between clinical parameters and MET gene amplification in the SHC tissues

表2 單因素分析SHC患者OS和DFS相關的危險因素Tab.2 Univariate analysis of OS and DFS in patients with SHC

圖3 Kaplan-Meier模型構建生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier estimated OS and DFS curves

表3 SHC COX回歸模型多因素預后分析結果Tab.3 Multivariate COX regression analysis of the prognostic factors for SHC

3 討 論

SHC是一種罕見的HCC組織學亞型，發(fā)病率僅占HCC手術切除病例的1.8%［13］。SHC侵襲性強，預后差，其相關分子病理學研究鮮有報道。本研究回顧性分析了22例SHC患者的臨床病理學特征，并對所有患者進行了MET基因擴增FISH檢測及預后相關分析，結果顯示：①SHC中存在較高比例（22.7%）的MET基因擴增；②MET基因擴增患者的生存期明顯低于MET陰性患者（中位OS：6.8個月vs24個月），MET基因擴增是影響SHC預后的獨立危險因素；③具有完整的腫瘤包膜、單灶腫瘤及CNLCⅠ期的患者預后較好。本研究為判斷SHC患者的預后引進了新的指標，也為SHC的靶向藥物治療提供了新的思路。

MET通路異常在非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌和HCC等腫瘤中均已被證實是明確的預后標志物［4-8］，而且在預測腫瘤靶向治療反應及腫瘤診斷方面也發(fā)揮著越來越重要的作用。通過對MET異常進行檢測，能夠篩選出可能從靶向治療中獲益的患者。其中，對存在MET異常的乳頭狀腎癌和非小細胞肺癌患者選用針對HGF/MET的靶向治療能夠獲得最為肯定的治療效果［9-10］。在其他腫瘤中，MET作為預測因子的價值不甚一致，其差異的根源可能在于對腫瘤組織內MET異常的檢測方法與診斷標準不同。此外，血漿或血清MET水平升高不僅同樣提示腫瘤預后不良，還可作為前列腺癌、黑色素瘤等腫瘤的診斷標志物［4，14-15］。

MET蛋白過表達、MET基因擴增或拷貝數增多以及MET基因突變（主要包括第14外顯子跳躍突變）均可導致腫瘤細胞中MET通路異常激活。3種異常改變最常用的檢測方法分別是免疫組織化學法、FISH法及基因測序法。有研究［16］顯示，雖然MET基因擴增見于MET蛋白陽性者，但MET基因擴增率遠低于免疫組織化學法檢測到的MET蛋白陽性率。因此，MET的免疫組織化學檢測結果不能替代MET基因擴增檢查，對于考慮選用腫瘤靶向藥物治療的患者，建議采用FISH法檢測MET基因擴增，免疫組織化學法可以作為篩查MET基因擴增患者的補充手段。本研究中5例FISH檢測MET基因表達結果呈陽性的患者中，2例腫瘤細胞內MET基因平均拷貝數≥5.0個且MET/CEP7比值≥2.0，另外3例腫瘤細胞內MET基因平均拷貝數≥5.0個而MET/CEP7比值＜2.0。由于FISH檢測MET基因表達結果呈陽性的病例數較少，因此在本文中將兩者一起分析討論。

SHC是典型的上皮-間質轉化性腫瘤。本研究發(fā)現MET擴增存在一定異質性，多見于肉瘤樣區(qū)域。一方面，這可能與肉瘤樣區(qū)域惡性程度較高有關，并與MET擴增提示預后差的結論相一致。另一方面，根據以往文獻報道，MET或許能夠通過促進間葉衍生祖細胞的增生，誘導肉瘤形成［17］。因此，MET多見于肉瘤樣區(qū)域提示其在HCC的肉瘤樣轉變中可能起到了一定的作用。

肝臟癌肉瘤也是肝臟罕見并且預后差的惡性腫瘤類型，肝臟癌肉瘤與肉瘤樣癌的鑒別診斷困難，常常是病理學醫(yī)師需要面對的難題。根據2000年版WHO消化系統腫瘤組織學分類［18］，肝臟癌肉瘤定義為由上皮樣成分（既可以是肝細胞源性也可以是膽管細胞源性）和肉瘤樣成分緊密混雜在一起的惡性腫瘤，其腫瘤中既有癌成分，又有肉瘤成分。如果構成肉瘤樣成分的梭形細胞仍然為上皮源性（表達上皮細胞標志物），則診斷為肉瘤樣癌。根據該定義，本研究的22例SHC患者中，6例肉瘤樣成分的梭形細胞未檢測到上皮細胞標志物表達，因此屬于癌肉瘤病例。而2010和2019年修訂版WHO消化系統腫瘤組織學分類將肝臟癌肉瘤定義為伴肉瘤樣分化的癌，也歸類為肉瘤樣癌。其中的肉瘤樣成分由分化差的HCC或肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）克隆進化而來，分別形成SHC與肉瘤樣ICC［1］。修訂后的版本在一定程度上提高了臨床診斷的一致性。有研究［3］比較了10例肝臟肉瘤樣癌及14例癌肉瘤的臨床病理學特征，提示肝臟癌肉瘤與肝臟肉瘤樣癌在病理學形態(tài)上相似，肝臟癌肉瘤的中位OS較肉瘤樣癌稍低（4.8個月vs9.6個月），但差異無統計學意義。因此，二者是否存在本質上的差異尚需更多分子病理學研究加以證實。