海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，海南 海口 570102

骨肉瘤是骨科常見的腫瘤之一，好發(fā)于青少年，惡性程度很高，易發(fā)生肺轉移［1］。當前常用的治療方法是手術治療加化療，但患者術后5年生存率依舊徘徊不前，且在化療藥物的使用過程中常發(fā)生耐藥［2］。目前，在手術治療、新的輔助化療藥物及免疫治療尚未取得巨大突破之前，尋找骨肉瘤治療的分子靶點及闡明骨肉瘤耐藥機制尤為重要。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，O-GlcNAc糖基化扮演著重要角色［3-4］。O-GlcNAc糖基化修飾廣泛參與細胞周期、基因轉錄、蛋白質翻譯加工及信號轉導等多種細胞生命過程［5］。其修飾異?？蓪е履[瘤、心血管疾病、糖尿病及阿爾茨海默病等多種疾病［6］。已有研究證實，O-GlcNAc糖基轉移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）在肝腫瘤［7］、胃腸道腫瘤［8］及膀胱癌［9］等腫瘤中高表達，然而在骨肉瘤中的表達及其影響機制的研究卻很少。本研究旨在分析骨肉瘤中OGT的表達水平，并觀察其對骨肉瘤細胞增殖和順鉑敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

骨肉瘤細胞株U2-OS及MG-63購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，OGT及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等抗體購自英國Abcam公司，細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）及5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司，流式細胞術凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，血清、DMEM培養(yǎng)基及胰酶購自德國BI公司，OGT過表達及沉默質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 組織標本

經(jīng)海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且所有患者知情同意后，收集51例手術切除的腫瘤組織及其相應的癌旁組織，新鮮的組織取下后立即放置于-80 ℃或置于固定液中固定，所有患者均經(jīng)病理學檢查診斷為骨肉瘤，所有患者術前均未接受任何抗腫瘤治療。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染

人骨肉瘤細胞U2-OS及MG-63用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中溫育。經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗后，用2.5%的胰酶消化細胞，計數(shù)后以每孔5×105個細胞接種于6孔板中。實驗分為shOGT質粒組和shNC空轉質粒組，過表達OGT組及過表達空轉質粒組。待細胞貼壁生長至60%～70%，按照LipofectamineTM3000試劑盒說明，分別將OGT沉默及過表達質粒轉染至骨肉瘤細胞中，并檢測其轉染效率。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

嚴格依據(jù)試劑盒說明要求，采用TRIzol法提取組織及細胞RNA，并測定其濃度，按照反轉錄試劑說明，將RNA反轉錄合成cDNA。取cDNA進行RTFQ-PCR。其條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，取平均值。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）

采用RIPA裂解液提取細胞蛋白，組織抽提試劑盒提取組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，調節(jié)蛋白濃度后添加6×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min使蛋白發(fā)生變性。每孔以30 μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，添加一抗OGT（稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃溫育過夜，經(jīng)TBST清洗后，添加二抗（山羊抗兔1∶5 000）室溫溫育1 h，最后采用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并分析。

1.6 免疫組織化學

新鮮的組織標本經(jīng)4%中性多聚甲醛緩沖液固定，常規(guī)進行脫水、浸蠟及石蠟包埋后，將其切成連續(xù)4 μm的切片。石蠟切片進行烤片，脫蠟后用檸檬酸鈉進行抗原修復，經(jīng)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉后，滴加以1∶200稀釋的OGT抗體，于4 ℃冰箱溫育過夜，采用兔二抗常溫溫育1 h，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 流式細胞術

按照既定的實驗分組，經(jīng)胰酶消化至腫瘤細胞部分脫落，用移液器輕柔將其吹落，收集細胞沉淀PBS清洗2遍，1 000 r/min離心5 min收集細胞，每孔加入100 μL的緩沖液，分別加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）及異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）染料，避光溫育30 min，上機進行檢測。

1.8 CCK-8

骨肉瘤細胞按shNC及shOGT進行分組，經(jīng)胰酶消化計數(shù)后，以每孔1×104個細胞接種于96孔板中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中溫育，于24、48及72 h后每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)溫育2 h，使用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（D）值，每孔設置3個復孔，實驗重復3次。

1.9 EdU

骨肉瘤細胞按shNC及shOGT進行分組，取對數(shù)生長的骨肉瘤細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照EdU試劑說明書，每孔加入50 μL EdU于37 ℃溫育2 h，100 μL 4%中性多聚甲醛緩沖液固定30 min，經(jīng)0.5%Triton-X滲透后加入100 μL Hoechst 33342溫育30 min，最后在熒光顯微鏡下觀察骨肉瘤細胞的增殖情況。

1.10 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行分析。采用t檢驗分析兩組間的差異，采用單因素方差分析比較兩組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中OGT的表達及與預后的關系

為研究OGT在骨肉瘤中的表達，首先通過免疫組織化學法檢測骨肉瘤組織及其相應的癌旁組織中OGT的表達水平，結果顯示，OGT在64.70%（33/51）的骨肉瘤組織中高表達，而在相應的癌旁組織中僅17.65%（9/51）表達升高（P＜0.01，圖1A）。進一步通過RTFQ-PCR及免疫印跡法檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中OGT mRNA及蛋白水平，結果顯示，骨肉瘤組織中OGT mRNA及蛋白水平顯著高于相應的癌旁組織（P＜0.01，圖1B～C）。接下來分析OGT的表達與患者臨床病理學特征的關系，結果顯示，OGT的表達與患者的年齡、性別、淋巴結轉移無明顯相關性，而與患者腫瘤的大小及病理學分期密切相關（表1）。最后分析OGT的表達與患者預后的關系，結果顯示，高表達OGT的患者預后差（P＜0.05，圖1D）。以上結果表明，骨肉瘤中OGT的表達水平顯著提升且與患者的預后密切相關。

2.2 降低骨肉瘤組織中OGT的表達顯著抑制其生長

有研究［10］報道，腫瘤的惡性生長與糖基化轉移酶的表達呈正相關。同樣，為分析OGT的表達水平與骨肉瘤生長的作用關系，首先采用shRNA沉默骨肉瘤細胞U2-OS中OGT的表達，RTFQ-PCR及Western blot證實OGT下調成功（P＜0.01，圖2A～B）。接下來通過CCK-8及EdU分析骨肉瘤細胞的生長能力，結果顯示，下調骨肉瘤細胞中OGT表達后，其增殖能力明顯減弱（P＜0.05，圖2C～D）。以上結果表明，OGT的表達與骨肉瘤細胞的生長密切相關。

圖1 骨肉瘤組織中OGT的表達及與患者預后的關系Fig.1 OGT expression in osteosarcoma tissues and its relationship with patient's prognosis

表1 OGT的表達與骨肉瘤患者的臨床數(shù)據(jù)分析Tab.1 Analysis of the relationship between OGT expression and clinical data of osteosarcoma patients

2.3 OGT在順鉑作用的骨肉瘤細胞中高表達

順鉑作為骨肉瘤的常用化療藥物，在腫瘤的治療中發(fā)揮巨大作用。然而骨肉瘤患者常發(fā)生順鉑耐藥，而其耐藥機制尚不完全明確，有研究［11］證實，O-GlcNAc糖基化與腫瘤順鉑耐藥密切相關。為證實其機制是否發(fā)生于骨肉瘤細胞中，首先采用不同濃度的順鉑作用于骨肉瘤細胞U2-OS及MG-63，采用RTFQ-PCR及Western blot檢測OGT蛋白的表達水平，結果顯示，隨著順鉑作用濃度的升高，骨肉瘤細胞中OGT的表達顯著提升（P＜0.05，圖3A～B）。進一步采用10 μmol/L的順鉑作用于骨肉瘤細胞，結果顯示，隨著時間延長，骨肉瘤細胞中OGT的表達顯著提升，且該作用能夠持續(xù)48 h（P＜0.05，圖3C～D）。以上結果表明，順鉑作用于骨肉瘤細胞后，OGT的表達顯著提升。

2.4 OGT的與順鉑藥物的敏感性相關

為進一步明確OGT在骨肉瘤順鉑耐藥中的作用，我們在沉默OGT的骨肉瘤細胞中加入順鉑，采用CCK-8檢測細胞活力，結果顯示，沉默骨肉瘤細胞中OGT的表達后，其細胞活力明顯減弱（P＜0.05，圖4A～B）。采用流式細胞術檢測細胞的凋亡情況，結果顯示，沉默骨肉瘤細胞中OGT蛋白的表達，順鉑的敏感性顯著增強（P＜0.05，圖4C～D）。相反，上調OGT的表達，順鉑的敏感性顯著減弱（P＜0.05，圖4E）。

圖2 降低骨肉瘤細胞中OGT的表達顯著抑制其生長Fig.2 Reducing the expression of OGT in osteosarcoma cells significantly inhibits their growth

圖3 OGT在順鉑作用的骨肉瘤細胞中高表達Fig.3 OGT is highly expressed in osteosarcoma cells treated with cisplatin

圖4 沉默OGT的表達顯著增強順鉑的敏感性Fig.4 Silencing OGT expression significantly enhances the sensitivity of cisplatin

3 討 論

近年來，雖然骨肉瘤的整體治療水平有了明顯提升，但骨肉瘤患者的生存率卻依舊不是很高，當前骨肉瘤常用治療方法仍然是手術治療和化療［12］。部分患者容易出現(xiàn)化療耐藥及轉移，因此亟待探尋骨肉瘤治療新的分子靶點和闡明骨肉瘤化療耐藥機制。已有研究［13］證實，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因及抑癌基因異常表達密切相關，O-GlcNAc糖基化在腫瘤的進展過程中扮演著重要角色。有研究證實，在肝癌［14］、乳腺癌［15］及非小細胞肺癌［16］等腫瘤中O-GlcNAc糖基化表達升高，且與患者的預后密切相關，在增殖迅速、發(fā)生轉移及惡性程度高的腫瘤中，O-GlcNAc糖基化水平較高。抑制腫瘤細胞中O-GlcNAc糖基化水平，其生長及轉移發(fā)生能力明顯減弱，相反細胞的凋亡比例顯著上升［17-18］。在骨肉瘤中，尚未見文獻報道其生長迅速是否與O-GlcNAc糖基化有關。本研究表明，OGT在骨肉瘤組織中表達升高，且與患者的預后密切相關，在骨肉瘤細胞中沉默OGT的表達后其生長明顯被抑制。另外，本研究也證實，OGT在順鉑作用的骨肉瘤細胞中表達水平升高，降低骨肉瘤細胞中OGT的表達后，能夠顯著增強骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性，然而其具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究揭示了OGT在骨肉瘤中的表達及其在順鉑耐藥中的作用，為骨肉瘤新的靶向治療及化療耐藥提供了新的理論依據(jù)。