徐先林，文 雯，孫澤敏，歐剛衛(wèi)

(遵義醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

抗生素的濫用或習(xí)慣性使用[1-2]導(dǎo)致耐藥菌大量出現(xiàn)和各類抗生素耐藥基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)在不同生態(tài)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移和傳播[3]。人類腸道中多種微生物共存，細(xì)菌通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移等[4]方式交換基因片段。已發(fā)現(xiàn)人類腸道微生物包含超過(guò)6 000種ARGs[5]，ARGs在腸道菌群間廣泛轉(zhuǎn)移可能破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，對(duì)人體健康造成威脅。

雖然臨床已經(jīng)多年很少使用四環(huán)素(Tetracycline, TC)類抗生素治療或預(yù)防感染性疾病[6]，但TC仍被大量用于防治多種動(dòng)物疾病以及家禽和家畜飼養(yǎng)中[7]，未被充分利用或代謝的TC被大量排泄到環(huán)境中[8]。我國(guó)不同地區(qū)和許多國(guó)家的污水和地表水等環(huán)境中均檢測(cè)到高濃度的TC殘留[9-10]，殘留的TC對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力，并通過(guò)移動(dòng)基因元件(Mobile genetic elements，MGEs)[11-12]在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。腸道微生物群長(zhǎng)期暴露于亞劑量TC中，有利于潛在耐藥菌生長(zhǎng)[13]。

腸道菌群具有高度抗生素耐藥性[14]，目前對(duì)無(wú)抗生素使用史腸道耐藥菌及相應(yīng)ARGs特征的認(rèn)識(shí)仍不清楚。本研究從兒童糞便中篩選TC耐藥菌并評(píng)估細(xì)菌攜帶TC耐藥基因情況，了解腸道內(nèi)可培養(yǎng)TC耐藥菌分布并分析耐藥基因與耐藥相關(guān)性，探討兒童腸道菌群攜帶TC耐藥基因的特點(diǎn)與規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便標(biāo)本采集 本研究招募了遵義市兒童4例(見(jiàn)表1)，均無(wú)TC使用史，征得監(jiān)護(hù)人同意后采集新鮮糞便樣本置于無(wú)菌EP管中，樣品編號(hào)為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4，低溫條件運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃，并盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 受試者的基本情況

1.1.2 主要藥物與試劑 四環(huán)素藥敏片(杭州微生物試劑有限公司)；四環(huán)素鹽酸鹽(50 mg/mL)(上海生工)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、布氏瓊脂(青島海博生物)；MH培養(yǎng)基(索萊寶生物)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(碧云天生物)；PCR Master Mix(2×)(Fermentas公司)；GoldView核酸染料(碧云天生物)；引物(上海生工)；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 TC耐藥菌株分離與保存 將糞便樣本分區(qū)劃線接種于TC選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行耐藥菌株的篩選與分離，TC篩選濃度(150 μg/mL)參考文獻(xiàn)[15]。為了盡可能篩選出更多細(xì)菌，采用多種培養(yǎng)基分別在有氧和厭氧條件下培養(yǎng)糞便樣本。有氧條件：蘸取少許樣本用分區(qū)劃線法接種于新配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂、腦心浸液、麥康凱、血平板等培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；隨機(jī)挑取平板上菌落外觀形態(tài)不同(大小、形態(tài)、顏色、邊緣情況、表面光澤、質(zhì)地和透明度等)的菌落數(shù)個(gè)，分區(qū)劃線接種于新的平板上，37℃培養(yǎng)24 h；重復(fù)純化2～3次，直至平板上形成外觀形態(tài)單一的菌落。厭氧條件：挑取少許樣本分區(qū)劃線接種于新配制的腦心浸液和血平板中，迅速放入3.5 L厭氧罐，并立即放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋(3.5 L，日本三菱)，封閉厭氧罐，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，同時(shí)以接種破傷風(fēng)桿菌(本校微免實(shí)驗(yàn)室提供)的平板作為厭氧條件驗(yàn)證；隨機(jī)挑選平板上形態(tài)不同的菌落數(shù)個(gè)，置于厭氧條件下37℃培養(yǎng)48～72 h；重復(fù)純化2～3次直至厭氧純化平板上形成單一菌落。保存所有菌株，非厭氧菌置于含20%甘油的液體培養(yǎng)基中保存于-80℃；厭氧菌采用半固體穿刺保存。

1.2.2 革蘭氏染色 采用革蘭氏染色對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步分類鑒定，確定革蘭氏染色情況。革蘭氏染色具體步驟參考文獻(xiàn)方法[16]，簡(jiǎn)單描述為如下8步：涂片、晾干、固定、染色、媒染、脫色、復(fù)染、鏡檢。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 采用16S rRNA基因PCR擴(kuò)增法進(jìn)行細(xì)菌鑒定，擴(kuò)增通用引物見(jiàn)表2。PCR模板制備：取菌體少許加入100 μL無(wú)菌水中，渦旋混勻后置于沸水浴中加熱10 min，稍冷后12 000 rpm離心1 min，上清液作為模板直接用于16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL)：上游引物(10 pmol/μL) 1 μL；下游引物(10 pmol/μL)1 μL；PCR Master Mix(2×) 25 μL；模板(空白對(duì)照組以蒸餾水代替)5 μL；蒸餾水 18 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，30次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，設(shè)定恒壓120V，電泳35min；在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD公司)下觀察結(jié)果，將能清晰分辨出目的條帶且具有一定亮度的PCR產(chǎn)物送至上海生工武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性對(duì)比鑒定細(xì)菌。鑒定方法參考文獻(xiàn)[17]。

表2 引物序列信息

1.2.4 TC藥敏試驗(yàn) 對(duì)所有細(xì)菌均進(jìn)行TC藥敏試驗(yàn)，非厭氧菌采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法，厭氧菌則采用瓊脂稀釋法。K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法：取菌落移至3～4 mL無(wú)菌生理鹽水中，渦旋振蕩混勻，用細(xì)菌比濁儀(法國(guó)梅里埃)調(diào)整其比濁度為0.50個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝唬粺o(wú)菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于MH瓊脂平板表面，室溫下干燥3～5 min，用無(wú)菌鑷子取TC藥敏紙片(含藥量30 μg/片)緊貼于平板表面，藥敏紙片距平板內(nèi)緣>15 mm，紙片之間距離不小于24 mm。將平板翻轉(zhuǎn)后置于37℃培養(yǎng)16～18 h，測(cè)量抑菌圈大小。根據(jù)CLSI(美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表3)，對(duì)各菌做出“敏感”、“中介”、“耐藥”的判斷。瓊脂稀釋法：取菌落直接懸浮于布氏肉湯培養(yǎng)基中，渦旋混勻，用細(xì)菌比濁儀調(diào)節(jié)菌液濁度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝弧?zhǔn)確量取已經(jīng)校正比濁度的菌液各2 μL分別滴在在含不同濃度TC(0、2、4、8、16、32、150 μg/mL)的強(qiáng)化布氏瓊脂平板上。待平板吸收完菌液后翻轉(zhuǎn)平板，迅速放入?yún)捬鯒l件，37℃培養(yǎng)42～48 h觀察結(jié)果，判讀最小抑菌濃度(MIC)終點(diǎn)。與無(wú)TC(0 μg/mL)的平板對(duì)比，細(xì)菌生長(zhǎng)顯著減少的TC濃度即為MIC值，并根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)做出敏感(≤4 μg/mL)、中介(8 μg/mL)和耐藥(≥16 μg/mL)的判斷。

表3 K-B紙片擴(kuò)散法TC藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 TC耐藥基因檢測(cè) 對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W) 8種四環(huán)素耐藥基因PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物基本信息見(jiàn)表2。PCR模板制備方法同1.2.3。擴(kuò)增體系20 μL：16S rRNA基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，16S rRNA基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，TC耐藥基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，TC耐藥基因下游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，模板(空白對(duì)照以蒸餾水代替)3 μL，蒸餾水5 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火溫度(見(jiàn)表2)45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。電泳檢測(cè)：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，調(diào)整電壓為120 V，電泳40 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定 通過(guò)TC篩選培養(yǎng)基進(jìn)行糞便培養(yǎng)，挑選出190個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，但在純化過(guò)程中有6株細(xì)菌未生長(zhǎng)，對(duì)余下184株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和16S rRNA基因測(cè)序鑒定。革蘭氏染色結(jié)果顯示，各細(xì)菌涂片清晰、顏色單一、細(xì)菌形態(tài)一致，無(wú)形態(tài)多樣和染色同時(shí)出現(xiàn)紫色和紅色及染色不清楚的情況(見(jiàn)圖1)，表明各菌株已經(jīng)完全純化，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；通用引物擴(kuò)增的16S rRNA基因大小約為1500 bp，采用雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用SeqMan軟件去除測(cè)序圖譜兩端峰形較亂的序列，拼接雙向測(cè)序結(jié)果，查找并修正其中拼接錯(cuò)誤。采用16S rRNA基因測(cè)序鑒定顯示共分離出163株非厭氧菌和21株厭氧菌，其中大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、遲緩埃格特菌、產(chǎn)氣柯林斯菌是主要細(xì)菌種類。4例糞便樣本的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

A：大腸桿菌；B：鳥(niǎo)腸球菌；C：青春雙歧桿菌；D：產(chǎn)氣柯林斯菌。圖1 部分菌株革蘭氏染色結(jié)果(倍數(shù)10 ×100)

表4 4例樣本中分離鑒定的細(xì)菌

2.2 TC藥敏試驗(yàn) 所有細(xì)菌均進(jìn)行TC藥敏試驗(yàn)，部分TC藥敏結(jié)果如圖2。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表5)可知，184株細(xì)菌表型耐藥率為93.5%，表型敏感率為6.5%，無(wú)中介率。大腸桿菌耐藥率為91.8%，腸球菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣科特斯菌、遲緩埃格特菌耐藥率均為100%。9株敏感大腸桿菌均來(lái)Z-1樣本，另外3株敏感菌來(lái)自Z-3和Z-4。全部細(xì)菌藥敏試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

A：屎腸球菌；B：大腸桿菌；C：大腸桿菌。圖2 部分細(xì)菌K-B紙片擴(kuò)散法四環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表5 184株細(xì)菌四環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 TC耐藥基因擴(kuò)增 根據(jù)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷是否擴(kuò)增出目標(biāo)耐藥基因，部分菌株耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。如表6、7所示，184株細(xì)菌中耐藥基因總檢出率為83.2%，12株TC敏感菌未檢出任何耐藥菌基因；其中tet(B)、tet(M)、tet(Q)、tet(W)、tet(A)檢出率分別為18.5%、32.1%、0.5%、8.7%、23.4%，未檢出耐藥基因比例為16.8%；172株耐藥菌中耐藥基因檢出率為89.0%，其中大腸桿菌主要檢測(cè)出tet(A)和tet(B)，腸球菌全部檢測(cè)到tet(M)，雙歧桿菌全部檢測(cè)到tet(W)，產(chǎn)氣柯林斯菌全部檢出tet(W)，19株耐藥菌(11.0%)未檢測(cè)到上述8種基因；所有細(xì)菌均未檢測(cè)到2種以上的耐藥基因，無(wú)細(xì)菌擴(kuò)增出tet(G)、tet(L)、tet(O)。

A：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；B：部分菌株tet(W)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，可見(jiàn)目的條帶(168 bp)和16S rRNA條帶(1500 bp)；C：部分菌株tet(G)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，可見(jiàn)16S rRNA條帶(1500 bp)，未見(jiàn)目的條帶(662 bp)。圖3 部分耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖

表6 四環(huán)素敏感菌耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

(續(xù)表7)

2.4 攜帶tet(A)與tet(B)的大腸桿菌抑菌圈大小比較 4個(gè)樣本耐藥基因檢出率分別為92.6%、95.0%、82.1%、84.6%，耐藥基因檢出率較高；各樣本中大腸桿菌攜帶tet(A)與tet(B)比例差異較大，Z-1中tet(B)檢出率為30.9%，tet(A)檢出率為17.4%；Z-2中無(wú)細(xì)菌檢測(cè)出tet(B)基因，tet(A)檢出率為88.9%；Z-3中tet(B)為檢出率21.4%，tet(A)為檢出率53.6%；Z-4中tet(B)檢出率為65.0%，tet(A)檢出率為35.0%。統(tǒng)計(jì)4個(gè)樣本中所有耐藥大腸桿菌藥敏及耐藥基因檢測(cè)情況發(fā)現(xiàn)，tet(B)陽(yáng)性大腸桿菌藥敏抑菌圈明顯小于tet(A)陽(yáng)性大腸桿菌(見(jiàn)表8，圖4)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑菌圈越小表明敏感性低、耐藥性更強(qiáng)。

表8 K-B紙片擴(kuò)散法四環(huán)素藥敏試驗(yàn)抑菌圈大小

圖4 tet(A)陽(yáng)性大腸桿菌與tet(B)陽(yáng)性大腸桿菌抑菌圈直徑比較

3 討論

由于腸道菌群的復(fù)雜性及細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的限制，分離的細(xì)菌種類和數(shù)量有限，不能全面分離腸道菌群中TC耐藥菌。但在現(xiàn)有技術(shù)條件下，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增等技術(shù)，分析腸道菌群TC耐藥情況、分析腸道細(xì)菌耐藥基因攜帶特點(diǎn)，對(duì)于初步了解兒童腸道菌群中可培養(yǎng)TC耐藥菌及TC耐藥基因攜帶情況，有助于深入了解耐藥基因在兒童腸道菌群中的分布狀態(tài)、存在方式和對(duì)兒童腸道菌群組成及遠(yuǎn)期健康的影響。本研究從4例兒童糞便中分離、鑒定出184株細(xì)菌(見(jiàn)表4)，細(xì)菌種類在樣本間有較大差異，除了受可培養(yǎng)方法的缺陷及篩選細(xì)菌數(shù)量較少有關(guān)外，還因腸道微生物群在生命早期隨腸道發(fā)育而形成，易受多種因素影響[23]，如腸道類型、出生胎齡、分娩類型、母乳喂養(yǎng)方法、斷奶期、生活方式、飲食習(xí)慣等。

雖然預(yù)先通過(guò)多種高濃度TC選擇性培養(yǎng)基篩選耐藥菌，然而TC藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：184株細(xì)菌中172株細(xì)菌為T(mén)C耐藥，另外12株表現(xiàn)出對(duì)TC敏感。當(dāng)通過(guò)高濃度的TC(150 μg/mL)篩選時(shí)，耐藥菌株能夠存活，其中有一些短暫性耐藥菌株，去除篩選壓力之后傾向于丟失存在于染色體外的耐藥基因[2]恢復(fù)其敏感狀態(tài)。在后續(xù)純化過(guò)程中去除TC的選擇性壓力后，攜帶耐藥基因?qū)λ拗鲗⑹遣焕蛩兀?xì)菌會(huì)有丟失抗性基因的趨勢(shì)，尤其是位于質(zhì)粒中的耐藥基因，可能重新建立其最初的敏感狀態(tài)，因此藥敏試驗(yàn)中有少數(shù)細(xì)菌為敏感菌。結(jié)果中敏感細(xì)菌不攜帶任何耐藥基因，耐藥細(xì)菌耐藥基因檢出率高達(dá)89.0%，表明細(xì)菌耐藥是由于耐藥基因的表達(dá)。腸道是轉(zhuǎn)運(yùn)ARGs的良好生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物群構(gòu)成了一個(gè)巨大的ARGs儲(chǔ)蓄庫(kù)。研究者通過(guò)成對(duì)比較建模方法從人類腸道菌群中鑒定出超過(guò)6 000種抗生素耐藥基因[5]，表明腸道環(huán)境中抗生素耐藥基因的巨大多樣性。課題組前期研究結(jié)果也已經(jīng)表明無(wú)TC直接使用史兒童糞便中存在著tet(B)、tet(Q)、tet(M)等多種TC耐藥基因(結(jié)果未展示)，但并不清楚耐藥細(xì)菌攜帶何種耐藥基因。本研究通過(guò)分離TC耐藥菌探討多種TC耐藥基因攜帶情況。tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)是常見(jiàn)的TC耐藥基因，tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)編碼外排泵蛋白，tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W) 編碼核糖體保護(hù)蛋白[24]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增上述8中耐藥基因，結(jié)果顯示不同耐藥基因檢出率各不相同(見(jiàn)表7)，而且樣本間各耐藥基因檢出率差異較明顯。大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及產(chǎn)期柯林斯菌是分離的主要細(xì)菌種類，屬于腸道共生菌。腸道共生菌是天生抗生素耐藥菌[14]，大腸桿菌主要檢測(cè)到tet(A)、tet(B)，腸球菌全部攜帶tet(M)，雙歧桿菌和產(chǎn)氣柯林斯菌全部檢測(cè)到tet(W)，表明特定種屬細(xì)菌可能攜帶不同優(yōu)勢(shì)耐藥基因[24]，且不能在物種間轉(zhuǎn)移[5,25]。雖然現(xiàn)已知腸道耐藥基因種類龐大，但不同耐藥基因檢出率可能和細(xì)菌種類密切相關(guān)，表明細(xì)菌多樣性影響耐藥基因的檢出率。抗生素在環(huán)境中高度殘留[9]及TC耐藥基因在環(huán)境中呈多樣性[26]，健康人群通過(guò)環(huán)境暴露和飲食攝取，腸道微生物群長(zhǎng)期暴露于亞治療劑量TC中，但結(jié)果中耐藥菌均檢測(cè)出單一耐藥基因并無(wú)兩種及以上耐藥基因檢測(cè)情況，表明腸道細(xì)菌無(wú)TC直接篩選壓力，細(xì)菌耐藥強(qiáng)度比預(yù)期要低。由于細(xì)菌耐藥基因的表達(dá)是耗能的，攜帶耐藥基因并表達(dá)對(duì)細(xì)菌是不利因素[27]，細(xì)菌傾向攜帶更少的耐藥基因。

表7 四環(huán)素耐藥菌耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

tet(A)、tet(B)均編碼外排泵蛋白，結(jié)果顯示tet(B)陽(yáng)性大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)中抑菌圈直徑明顯小于tet(A)陽(yáng)性菌株(P<0.05)，與Karami研究[28]結(jié)果相似，表明攜帶tet(B)基因的菌株耐藥強(qiáng)度可能大于tet(A)基因攜帶者。4份糞便樣本tet(B)和tet(A)陽(yáng)性大腸桿菌比例差異較大(見(jiàn)表7)，表明個(gè)體差異可能導(dǎo)致細(xì)菌攜帶不同耐藥基因呈現(xiàn)不同耐藥強(qiáng)度，由于代謝狀態(tài)會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性[29]，推測(cè)這種差異可能和代謝差異有關(guān)。

因此，耐藥除了與耐藥基因表達(dá)耐藥蛋白有關(guān)外，還可能與細(xì)菌自身代謝狀態(tài)有關(guān)。結(jié)果中11.0%的耐藥菌未檢測(cè)到任何耐藥基因，可能攜帶著其它未檢測(cè)的耐藥菌基因，更可能是它們屬于表現(xiàn)耐藥，即為持留菌[30]，并不攜帶任何耐藥基因，其耐藥機(jī)制可能涉及細(xì)胞代謝狀態(tài)改變。細(xì)菌對(duì)亞治療水平的TC暴露反應(yīng)具有種特異性、濃度依賴性，因特定細(xì)菌比例不同導(dǎo)致腸道細(xì)菌代謝狀態(tài)不同[31]，細(xì)菌代謝狀態(tài)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，細(xì)菌代謝生理的變化影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性而促進(jìn)耐藥與持留產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)菌代謝能夠恢復(fù)抗生素敏感性[32]。既然細(xì)菌代謝與耐藥有關(guān)，那細(xì)菌代謝是否又會(huì)影響耐藥基因種屬特異性？腸道菌群龐大，抗生素與細(xì)菌之間的相互作用及其對(duì)宿主的影響非常復(fù)雜，細(xì)菌代謝如何影響抗生素耐藥值得進(jìn)一步研究。

人體即使無(wú)直接TC使用史，其腸道菌群仍受到環(huán)境或食物來(lái)源的多種抗生素的影響，不同耐藥菌攜帶著種屬特異性耐藥基因；不同個(gè)體間的大腸桿菌可能攜帶不同優(yōu)勢(shì)耐藥基因而表現(xiàn)出不同的耐藥強(qiáng)度。由于樣本間細(xì)菌耐藥率和耐藥菌顯現(xiàn)出差異性，那么這些差異是否和腸道菌群代謝密切相關(guān)？TC對(duì)腸道菌群代謝的影響及菌群整體代謝狀態(tài)如何影響細(xì)菌耐藥性仍有待探討。