張 意，周時(shí)高，王興榮，陸偉蘭，熊 漫，王 淼

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 中醫(yī)經(jīng)典病房，上海 徐匯 200032；2.上海市金山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 內(nèi)科，上海 金山 200082)

肥胖(Obesity)、2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)以及非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)均是與生活方式密切相關(guān)的內(nèi)分泌代謝疾病，三者之間關(guān)系密切。脂代謝異常是三者之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而脂代謝相關(guān)指標(biāo)，如血漿甘油三酯(Triglyceride,TG)可作為一種簡(jiǎn)單有效的方法用來評(píng)估T2DM、NAFLD以及心血管疾病等內(nèi)分泌代謝性相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。

MicroRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，可以通過與靶基因miRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體抑制miRNA的翻譯或直接降解miRNA，從而沉默編碼基因的表達(dá)。研究表明，miRNA在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，起著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA可以通過調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和程序性死亡等多種生理病理過程來影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展[2-3]。miRNA也可以通過調(diào)控機(jī)體的炎癥、氧化應(yīng)激以及自噬等多種通路途徑來調(diào)節(jié)其脂肪細(xì)胞分化情況和糖脂代謝水平[4-5]。調(diào)查顯示，人體血漿中的miRNA譜與其它組織器官存在著顯著的表達(dá)差異，這提示了組織細(xì)胞會(huì)選擇性的分泌釋放部分miRNA參與機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)[6]。由于miRNA在調(diào)節(jié)脂肪組織的分布及代謝功能中起著重要的作用[7]，因此，循環(huán)miRNA就可能成為診斷和治療肥胖及其相關(guān)疾病潛在的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)記物[8]。本研究中，我們應(yīng)用了miRNA芯片和定量RT-PCR的檢測(cè)方法，比較了高甘油三酯血癥患者和健康對(duì)照組人群血漿miRNA的表達(dá)差異，篩選出可能作為高甘油三酯血癥的診斷標(biāo)志物以及作為肥胖、非酒精性脂肪性肝病等脂代謝異常疾病的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年12月至我院體檢的高甘油三酯血癥患者137例及健康對(duì)照人群161例納入研究。高甘油三酯血癥組：男52例，女85例；年齡38～73歲，平均年齡(41.1±10.2)歲。健康對(duì)照組：男64例，女97例；年齡35～74歲，平均年齡(39.3±10.6)歲。兩組一般資料納入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行對(duì)比，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本試驗(yàn)的開展已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～75歲，患者及家屬均充分了解本次研究?jī)?nèi)容，并簽訂相關(guān)知情同意書；②高甘油三酯血癥組的診斷參照2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《中國(guó)成年人血脂異常防治指南》，即TG≥1.7 mmol/L；③健康對(duì)照組患者的血脂屬于正常范圍。

排除標(biāo)準(zhǔn)：膽囊疾病、腎臟疾病、精神疾病、認(rèn)知障礙、交流障礙、血液疾病、免疫性疾病等；1月內(nèi)有酗酒以及過度吸煙、因用藥導(dǎo)致血脂水平異常升高的患者。

1.2 血漿分離和miRNA抽提 每例患者收集 EDTA抗凝全血5 mL，靜置15 min后于4℃ 1620 g的條件下離心15 min，取上清至無菌無RNase的離心管中即為血漿樣本。

血漿miRNA的提取使用mirVana PARIS試劑盒(Ambion，US)，按照試劑盒說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的total RNA抽提，抽提所得經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies，Santa Clara，US)電泳質(zhì)檢合格后備用。

1.3 芯片實(shí)驗(yàn) miRNA芯片使用的是Agilent Human miRNA(8*60K)V21.0芯片，miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)來源于Sanger microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRbase)21.0版本，覆蓋了2549個(gè)人類相關(guān)的miRNAs。

樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套提供的試劑盒miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent technologies，Santa Clara，US)，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程的標(biāo)記部分對(duì)樣品中的miRNA分子進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。樣品在滾動(dòng)雜交爐中滾動(dòng)雜交20 h，雜交完成后在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent technologies，Santa Clara，US)。芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 12.6進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR miRNA的逆轉(zhuǎn)錄選用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，Beijing，China)，RT-PCR選用miRcute Plus miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(TIANGEN，Beijing，China)將稀釋引物至10μM，稀釋探針至5μM，以U6作為內(nèi)參照，目的基因和參照基因每個(gè)組各設(shè)至少兩個(gè)復(fù)孔，按照試劑盒說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行操作實(shí)驗(yàn)，用ABI Step One Plus Real-Time PCR System進(jìn)行融解曲線分析(Melting/Dissociation Curve Analysis)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火34 s，40～45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 本研究共納入高甘油三酯血癥患者137例及健康對(duì)照人群161例。比較兩組研究對(duì)象之間年齡、性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高甘油三酯血癥組(Hypertriglyceridemia，HTC)血漿甘油三酯高于健康對(duì)照組(Normal triglyceride，NTC)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 298例臨床樣本資料分析

2.2 miRNA芯片實(shí)驗(yàn) 分別選取高甘油三酯血癥患者及健康對(duì)照人群血漿樣本各3例進(jìn)行miRNA芯片實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)芯片結(jié)果的比較和分析，計(jì)算樣本之間的相關(guān)系數(shù)。樣品相關(guān)系數(shù)圖顯示兩組研究對(duì)象之間的基因表達(dá)存在顯著差異(見圖1A)。原始數(shù)據(jù)通過Gene Spring Software軟件進(jìn)行歸一化，得到的差異基因散點(diǎn)圖同樣顯示兩組間存在表達(dá)顯著差異的基因位點(diǎn)(見圖1B)。最終，采用表達(dá)差異倍數(shù)(Fold change)以及t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，選出12個(gè)有顯著差異的miRNAs，詳見表2。

表2 miRNA芯片表達(dá)差異分析

A：miRNA芯片實(shí)驗(yàn)樣品相關(guān)性系數(shù)圖，表示樣品基因之間的表達(dá)關(guān)系及差異情況；N：健康對(duì)照組；H：高甘油三酯血癥組；B：差異基因散點(diǎn)圖，落在圖形中位線兩側(cè)45°線之外的點(diǎn)，代表這個(gè)探針點(diǎn)在兩張芯片中信號(hào)值差異fold change>2，g1：健康對(duì)照組，g2：高甘油三酯血癥組。圖1 miRNA芯片實(shí)驗(yàn)樣品相關(guān)性系數(shù)圖和差異基因散點(diǎn)圖

2.3 RT-PCR 根據(jù)miRNA芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針及特異性擴(kuò)增引物，本研究選用U6作為內(nèi)參基因。miRNAs的特異性引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見表3。

表3 RT-PCR引物序列

在全部298例臨床樣本中針對(duì)miRNA芯片篩選出的12個(gè)候選miRNAs采用RT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照人群相比，高甘油三酯血癥患者血漿hsa-miR-4728-3p表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而包括miR-6716-5p、miR-193b-5p、miR-7855-5p、miR-30c-2-3p、miR-4508、miR-3187-3p、miR-5584-5p、miR-198、miR-6774-5p、miR-151b、miR-6891-3p在內(nèi)的其余11個(gè)miRNAs在兩組之間血漿表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05，見圖2)。

圖2 miRNA血漿表達(dá)水平差異

3 討論

近年來，隨著肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等多種以糖脂代謝紊亂為代表的慢性內(nèi)分泌代謝疾病的廣泛流行，各國(guó)的醫(yī)療工作者已經(jīng)進(jìn)行了大量相關(guān)研究。研究認(rèn)為，各種以糖脂代謝紊亂為標(biāo)志的代謝性疾病，其中心環(huán)節(jié)在于胰島素抵抗，而在胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展過程中，肥胖是一個(gè)重要的影響因素[9]。肥胖患者過度堆積的內(nèi)臟脂肪會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的異常肥大，而肥大的脂肪細(xì)胞由于其細(xì)胞膜上胰島素受體數(shù)量的相對(duì)減少，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體胰島素敏感性及反應(yīng)性的降低，從而引發(fā)胰島素抵抗[10]。胰島素抵抗，又會(huì)使外周組織對(duì)葡萄糖的利用率和對(duì)肝糖原生成的抑制作用明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致游離脂肪酸的升高[11]。升高的游離脂肪酸可使胰島β細(xì)胞中甘油三酯和神經(jīng)酰胺的合成增多，其中，甘油三酯的異常增高又會(huì)促使脂肪重新分布，在一定程度上加重肥胖的程度[12]。由此，糖脂代謝的異常就形成了互為因果的惡性循環(huán)。

研究顯示，miRNA可有效控制炎癥、改善胰島素抵抗、抑制脂滴的形成[13-14]。本研究通過對(duì)高甘油三酯血癥患者和健康對(duì)照人群的血漿miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，希望找出能夠作為高甘油三酯血癥的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。目前，人類基因庫(kù)中已發(fā)現(xiàn)2 000多種miRNA，參與了人體內(nèi)半數(shù)以上mRNA的調(diào)控環(huán)節(jié)，人體外周血液循環(huán)中也存在穩(wěn)定表達(dá)且數(shù)量較多的miRNA，miRNA可作為一類新型的疾病生物標(biāo)志物[15]。miRNAs與肥胖和糖尿病關(guān)系密切，其通過諸多代謝關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝及線粒體功能等，進(jìn)而參與代謝性疾病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在機(jī)體糖脂代謝紊亂的病理狀態(tài)下，相關(guān) miRNA 的表達(dá)能夠快速、顯著的出現(xiàn)異常，比如：有研究表明高脂血癥患者的miR-365的表達(dá)水平明顯高于正常個(gè)體[16]；在高糖高脂的刺激下，血清miR-25-5p、miR-4658、miR-4773、miR-4132、miR-5771-5p和miR-3165在人群中顯著升高，miR-130b和miR-494-5p明顯降低[17]；miR-7在胰島細(xì)胞中高表達(dá)并參與了胰島素的生物合成和分泌等過程[18]；miR-126通過調(diào)節(jié)靶向胰島素受體底物1的水平間接參與了胰島素抵抗的發(fā)展[19]。因此，miRNAs可能成為代謝性疾病診斷和預(yù)后的重要潛在生物標(biāo)志物。

我們的芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步篩選出二者之間表達(dá)顯著異常的12個(gè)miRNAs，而后通過RT-PCR的方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照人群相比，高甘油三酯血癥血漿hsa-miR-4728-3p表達(dá)水平明顯升高。有趣的是，在與腫瘤相關(guān)的研究中，預(yù)測(cè)miR-4728-3p的靶基因共有54個(gè)，靶基因功能主要富集于轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合及蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸結(jié)合等方面[20]；miR-4728-3p被認(rèn)為能夠下調(diào)MAPK信號(hào)通路的表達(dá)水平，而MAPK/mTOR信號(hào)通路能有效抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生[21-22]。最新研究表明，自噬在細(xì)胞脂質(zhì)代謝的過程中起著至關(guān)重要的作用[23]。脂肪細(xì)胞因子的異常釋放能夠激活細(xì)胞的自噬信號(hào)通路，從而清理細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器以及脂滴等脂毒性代謝產(chǎn)物，改善機(jī)體的炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)節(jié)脂肪的重新分布[24-25]。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬水平，保障細(xì)胞的代謝活力就成為了治療糖脂代謝紊亂疾病的一個(gè)有效途徑。我們認(rèn)為，高甘油三酯血癥患者血漿miR-4728-3p表達(dá)水平的升高，很可能揭示了機(jī)體應(yīng)激性自噬激活的生理過程，而該miRNA則有可能成為脂代謝異常疾病，尤其是高甘油三酯血癥的治療靶點(diǎn)。

值得一提的是，在之前的一些研究中有報(bào)道m(xù)iR-30c能夠影響人體脂肪的重新分布以及脂肪細(xì)胞因子的釋放[26]。高表達(dá)的miR-30c可以抑制纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的mRNA和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和遷移能力明顯增強(qiáng)，從而參與代謝相關(guān)的心血管疾病[27]；miR-30c還能通過沉默自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，抑制自噬，從而保護(hù)糖代謝紊亂時(shí)的心臟功能，NF-κB是miR-30c重要的正向調(diào)控因子[28]；MiR-30c能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡發(fā)揮抑癌作用，RAS/MAPK/ERK為MiR-30c的主要信號(hào)調(diào)控通路[29]。然而，在本研究中，盡管芯片實(shí)驗(yàn)的初步篩選過程中發(fā)現(xiàn)了血漿miR-30c-2-3p水平的異常表達(dá)，但是，在后續(xù)的RT-PCR驗(yàn)證中該miRNA在兩組人群之中卻并未顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)差異(見圖2)?？紤]到可能是由于本研究樣本量較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)離散度較大所致，因此，在后續(xù)的研究過程中應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量以明確該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，雖然本研究明確了miR-4728-3p與高甘油三酯血癥的相關(guān)性，進(jìn)而通過文獻(xiàn)對(duì)比提出了該miRNA可能通過MAPK/mTOR自噬信號(hào)通路影響脂肪細(xì)胞因子的釋放，然而，其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，我們希望能夠通過進(jìn)一步深入的研究驗(yàn)證并明確其作用靶點(diǎn)，為糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病帶來全新的治療思路和方法。