倪衛(wèi)娟，王 超，倪殿軍，李歸宿

(1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518109；2.杭州市腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，浙江 杭州 310000；3.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣東 深圳 518109)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲性惡性腫瘤。根據(jù)WHO制定的分級系統(tǒng)可將腦膠質(zhì)瘤分為4級，其中1～2級者代表低級別膠質(zhì)瘤，表示惡性程度較低、預(yù)后效果好；3～4級者代表高級別膠質(zhì)瘤，表示惡性程度較高、預(yù)后效果差[1-2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤會影響大腦功能，倘若其生長位置特殊和生長速度較快還可能導(dǎo)致患者生命受到威脅，因此積極、有效治療尤為重要[3]。目前，關(guān)于該病的治療方法包括手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、靶向療法和實驗性臨床試驗[4]。然而，由于臨床對于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚不十分清楚，在外科手術(shù)和輔助治療方面雖然取得了一定的進展，但惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時間幾乎不會改善[5]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，探究腫瘤侵襲的分子機制和新的治療靶標為癌癥治療開辟了新的思路。

β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(Beta-transducinrepeats-containingproteins，β-TrCP)是F-box蛋白家族的成員，是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)型泛素連接酶E3的關(guān)鍵組分。β-TrcpDg能夠通過識別并泛素化降解特異性磷酸化底物，如IKB、β-catenin、Emil和Snail等進而對NF-κB信號通路、Wnt信號通路、細胞周期和細胞侵襲轉(zhuǎn)移等進行調(diào)控，影響細胞的生長、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生[6-7]。近年來，已鑒定出許多β-TrCP底物，包括Bmi1，β-catenin，Emi1等[8-9]。其中B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，Bmi-1)在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達趨勢[10-11]。盡管對β-TrCP的基本生物學(xué)和發(fā)病機理的理解已有實質(zhì)性進展，但對β-TrCP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的可能作用和臨床意義了解甚少。對此，本研究通過臨床組織樣品和細胞實驗來探索神經(jīng)膠質(zhì)瘤中β-TrCP與Bmi-1的上下游表達關(guān)系，為β-TrCP在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展中所產(chǎn)生的作用提供有關(guān)的重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集我院神經(jīng)外科手術(shù)后的腦膠質(zhì)細胞瘤標本及非腫瘤腦組織標本，共收集臨床組織樣品78例。其中，WHO1～2級24例(WHO1～2)，WHO3～4級38例(WHO3～4)，非腫瘤腦組織臨床樣本16例(NC)。樣本均保存于-80℃冰箱。

1.1.2 細胞 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U87)購于中科院上海細胞庫。

1.1.3 試劑 BMI1 Rabbit Polyclonal一抗，β-TrCP Rabbit Polyclonal一抗，β-actin Rabbit Monoclonal antibody一抗和羊抗兔IgG-HPR二抗抗體均購于武漢Proteintech公司；細胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國Gibco公司；蛋白定量試劑盒和熒光定量試劑盒購于上海貝博生物公司；腺病毒和轉(zhuǎn)染試劑及siRNA均購于吉馬基因公司。

1.2 方法

1.2.1 U87細胞培養(yǎng) U87細胞用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)基在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 U87細胞轉(zhuǎn)染β-TrCP過表達腺病毒 培養(yǎng)U87細胞于六孔板中，細胞設(shè)置為3組，分別為空白對照組(NC，無添加)、陽性對照組(Control，添加無目的基因序列的病毒Vector)、實驗組(ad-β-TrCP，添加含有β-TrCP基因的腺病毒)。正式實驗之前檢測不同濃度病毒轉(zhuǎn)染效率，選取轉(zhuǎn)染率90%左右病毒濃度用于實驗。實驗組將50 μL病毒原液加入培養(yǎng)液中稀釋至1.5 mL，待細胞生長密度約70%分別加入1.5 mL 病毒稀釋液于細胞中。在細胞感染后12～48 h之間更換培養(yǎng)基，搖勻。待細胞密度90%左右收取細胞樣品于-80℃保存。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染β-TrCP沉默 培養(yǎng)U87細胞于六孔板中，細胞設(shè)置為3組，分別為空白對照組(NC，只添加轉(zhuǎn)染試劑)、陽性對照組(Control，添加轉(zhuǎn)染試劑和無目的基因序列的siRNA)、實驗組(si-β-TrCP，添加添加轉(zhuǎn)染試劑和含有β-TrCP基因的siRNA)。正式實驗之前，檢測不同濃度siRNA的沉默效率，選取沉默效率70%左右siRNA濃度(100 nM)進行實驗。實驗組將siRNA加入培養(yǎng)液中稀釋至1.5 mL，待細胞生長密度約70%分別加入細胞中。在細胞轉(zhuǎn)染后12～48 h更換培養(yǎng)基，搖勻。待細胞密度90%左右收取細胞樣品于-80℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測組織標本β-TrCP及Bmi-1基因表達 利用TRizol法提取組織樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計合適的引物(序列見表1)，按照熒光定量PCR試劑盒完成擴增反應(yīng)，即95℃ 5min，95℃ 10 s和95℃ 45 s循環(huán)40次，結(jié)果以2-ΔΔCt計算相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測細胞樣品β-TrCP及Bmi-1蛋白表達 向收集到的細胞樣品中加入100 μL含有1%蛋白酶磷酸抑制劑的蛋白裂解液，裂解離心后取上清蛋白。使用BCA Protein Quantification Kit試劑盒測定蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后進行封閉，將一抗按要求稀釋至最佳孵育濃度，4℃搖床一抗(BMI1一抗1∶2 000，β-TrCP一抗1∶2 000，β-actin一抗1∶5 000 )孵育過夜。第二天孵育二抗(羊抗兔IgG-HPR二抗1∶5 000)后進行ECL顯色，Image lab進行掃描成像并處理圖像和半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本中β-TrCP和Bmi-1的基因表達 如圖1所示，與非腫瘤組織比較，不同級別膠質(zhì)瘤組織樣本中β-TrCP基因的表達水平均顯著低于非腫瘤組織(P<0.01)，Bmi-1基因的表達水平則顯著高于非腫瘤組織(P<0.01)。其中，WHO3～4級膠質(zhì)瘤的β-TrCP表達水平顯著低于WHO1～2級別膠質(zhì)瘤(P<0.05)，但WHO3～4級膠質(zhì)瘤的Bmi-1基因表達水平顯著高于WHO1～2級別膠質(zhì)瘤(P<0.05)。

A：實時熒光定量檢測膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中β-TrCP基因表達統(tǒng)計圖，β-actin為內(nèi)參；B：實時熒光定量檢測膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中Bmi-1基因表達統(tǒng)計圖，β-actin為內(nèi)參；采用t-test檢驗統(tǒng)計學(xué)差異，與NC組相比，*:P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001具有顯著差異性。圖1 β-TrCP和Bmi-1基因在膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中的表達

2.2 U87細胞中β-TrCP過表達后Bmi-1的蛋白表達 利用在U87細胞中感染腺病毒的方法使β-TrCP在細胞中高表達，實驗結(jié)果如圖2，感染帶有目的基因片段的腺病毒后，U87細胞中β-TrCP蛋白表達顯著增加，而Bmi-1蛋白的表達被抑制，呈現(xiàn)出低表達水平(P<0.001)。

2.3 U87細胞中β-TrCP沉默后Bmi-1的蛋白表達 實驗結(jié)果如圖3，β-TrCP基因沉默表達后，U87細胞中β-TrCP蛋白表達被顯著抑制，而Bmi-1蛋白的表達顯著增加(P<0.01)。

A：蛋白免疫印跡檢測β-TrCP和Bmi-1蛋白表達電泳圖，β-actin為內(nèi)參；B：3組細胞β-TrCP表達相對定量統(tǒng)計圖；C：3組細胞Bmi-1表達相對定量統(tǒng)計圖；采用t-test檢驗統(tǒng)計學(xué)差異，與NC組相比，***:P<0.001具有顯著差異性。圖2 在U87細胞中過表達β-TrCP后檢測β-TrCP和Bmi-1的蛋白表達

A：蛋白免疫印跡檢測β-TrCP和Bmi-1蛋白表達電泳圖，β-actin為內(nèi)參；B：3組細胞中β-TrCP表達相對定量統(tǒng)計圖；C：3組細胞中Bmi-1表達相對定量統(tǒng)計圖；采用t-test檢驗統(tǒng)計學(xué)差異，與NC組相比，**:P<0.01，***:P<0.001具有顯著差異性。圖3 在U87細胞中沉默β-TrCP后檢測β-TrCP和Bmi-1的蛋白表達

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生在大腦和脊髓中的腫瘤，其始于周圍神經(jīng)細胞及幫助其發(fā)揮功能的膠狀支持細胞，如神經(jīng)膠質(zhì)細胞。像大多數(shù)原發(fā)性腦腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤的確切原因尚不清楚，但其發(fā)病率居神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤首位，根據(jù)WHO分型共分為4級。其中，1級和2級膠質(zhì)瘤細胞生長較緩慢，又稱作低級別膠質(zhì)瘤，而生長較為快速的3級和4級則被定義為高級別膠質(zhì)瘤。近年來，隨著靶向治療的發(fā)展，探究疾病的發(fā)生機制并尋找治療的基因靶點對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診療至關(guān)重要。

哺乳動物會表達兩個β-TrCP旁系同源物，分別為β-TrCP1和β-TrCP2。兩者具有相似的氨基酸序列和功能。有研究表明，β-TrCP可以在人骨肉瘤細胞系U2OS中泛素化降解Bmi-1蛋白從而達到治療的目的[12]。結(jié)合文獻，我們推測在膠質(zhì)瘤中β-TrCP可能也存在著可以下調(diào)Bmi-1的機制功能。在我們的研究中，與非腫瘤組織相比，膠質(zhì)瘤組織中β-TrCP1呈現(xiàn)低水平表達，但Bmi-1基因表達水平顯著較高；且與低級別膠質(zhì)瘤(WHO1～2)相比，高級別膠質(zhì)瘤(WHO3～4)的β-TrCP1基因表達顯著降低。可以推測，β-TrCP1和Bmi-1在腫瘤組織中具有特征性表達。此外，在U87細胞中沉默β-TrCP1表達足以引起B(yǎng)mi-1蛋白積聚，但過表達β-TrCP1則顯著抑制Bmi-1蛋白表達，這說明β-TrCP1和Bmi-1具有顯著相關(guān)性。大量文獻表明，β-TrCP1和β-TrCP2均具有一個保守的功能模塊F-box域，該模塊將底物橋接至功能性E3泛素SCF復(fù)合體，而β-TrCP1促進降解的能力在很大程度上取決于其與底物的磷酸化依賴性結(jié)合[13]。本文的研究數(shù)據(jù)也表明Bmi-1的基因表達在某種程度上受到β-TrCP1的調(diào)控。

隨著研究的深入，多種β-TrCP 底物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中Emi1主要通過對細胞周期和細胞周期相關(guān)的蛋白因子的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)β-TrCP的調(diào)控。在多種腫瘤細胞中，Bmi-1呈現(xiàn)高表達水平并通過參與腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在某些人大腸腫瘤中，β-catenin的積累與高水平的β-TrCP1伴隨。此外，β-TrCP的積累還會增加NF-κB的反式激活，這暗示由Wnt的持續(xù)激活或β-連環(huán)蛋白或APC中的致癌突變引起的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定可能有助于腫瘤細胞依賴NF-κB的存活[15]。在前列腺癌中，β-TrCP的過度表達即能夠提高HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，降低β-TrCP的表達成為抗腫瘤治療的新途徑[16]。另有報道發(fā)現(xiàn)，β-TrCP可通過促進泛素蛋白水解作用，抑制血管生成以及甲狀腺癌細胞遷移或減弱癌細胞增殖侵襲能力[17]。然而，由于內(nèi)源性β-TrCPs呈低水平表達，其功能很容易被顯性負性構(gòu)建體或抑制性底物抑制[18]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)β-TrCP1蛋白表達水平，會導(dǎo)致Bmi-1蛋白表達下調(diào)，提示Bmi-1蛋白表達下調(diào)可能是由β-TrCP1介導(dǎo)的翻譯后修飾反應(yīng)所引起。隨后進一步研究β-TrCP1與Bmi-1表達存在的相關(guān)性。實驗表明，在siRNA敲低β-TrCP1表達后，Bmi-1表達顯著提高；而在β-TrCP1過表達后，Bmi-1表達顯著降低。結(jié)合以往研究[19]分析可知，β-TrCP1與Bmi-1表達具有上下游的調(diào)節(jié)關(guān)系。

綜上，本次研究結(jié)果顯示β-TrCP和Bmi-1的表達與膠質(zhì)瘤具有密切關(guān)系。Bmi-1作為β-TrCP的底物，與β-TrCP之間具有相互調(diào)節(jié)關(guān)系，即β-TrCP的高表達會抑制Bmi-1的表達，而β-TrCP的低表達會解除對Bmi-1的抑制作用。這種相互關(guān)系對研究膠質(zhì)瘤的病理特征及疾病靶標具有參考作用。