仇治梅，陳文明，王 艷，石 蓓

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary atherosclerotic heart disease,CHD)目前已成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的重要原因[1]。其常見的治療方式為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention,PCI)，但PCI本身所造成的血管內(nèi)膜機(jī)械性損傷，導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄(Restenosis in-stent,RS)的發(fā)生、發(fā)展，嚴(yán)重影響介入術(shù)后患者的生存質(zhì)量和遠(yuǎn)期預(yù)后[2]。PCI術(shù)后RS發(fā)生的主要原因是血管內(nèi)膜損傷后誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)過(guò)度增殖，由中膜遷移至內(nèi)膜，導(dǎo)致管壁增厚，最終導(dǎo)致RS的形成[3]。故而，抑制血管平滑肌的過(guò)度增殖遷移是治療RS的關(guān)鍵。

人參為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補(bǔ)氣益肺、安神益智的功效。人參皂苷(Ginsenosides,GS)是人參生理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3，GSRg3)屬四環(huán)三萜類皂苷。近年來(lái)對(duì)GSRg3的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[4]、降低化療藥物的心臟毒性和腎毒性[5]、抗疲勞[6]等廣泛藥理作用。但是，GSRg3對(duì)血管再狹窄方面的研究較少。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中，GSRg3能抑制頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生[7]，說(shuō)明GSRg3有抗血管再狹窄效應(yīng)，但是具體的作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究通過(guò)觀察GSRg3對(duì)體外培養(yǎng)VSMCs凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 GSRg3(批號(hào)為ZL20161016，純度>98%，購(gòu)自上海篤瑪生物科技有限公司)；MTT(Sigma公司，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)液、青霉素(10 000 μg/mL)/鏈霉素(10 000 μg/mL)雙抗、胰酶(HyClone公司，美國(guó))；胎牛血清(MRC公司，澳大利亞)；凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技公司)；SM α-actin抗體、β-actin抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體(博士德公司)；cleaved caspase 3、cleaved caspase 9(CST公司，美國(guó))；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Proteintech，美國(guó))；SD大鼠10只，雌雄不限，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 SD大鼠斷頸處死，浸泡于75%乙醇中10 min，無(wú)菌條件下取出胸主動(dòng)脈，置于4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS中，去除血管外膜附著組織，直鑷夾住胸主動(dòng)脈一端，彎鑷沿直鑷端滑至對(duì)側(cè)端，快速袖套樣剝脫外膜，眼科剪縱向剖開血管，無(wú)菌棉簽于血管內(nèi)膜表明刮去血管內(nèi)膜細(xì)胞，預(yù)冷無(wú)菌DMEM清洗。將血管組織剪為1.0 mm3大小組織塊，將組織塊按3～5塊/cm2密度接種到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，瓶底向上，加入2 mL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6 h后原位緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，72 h換液。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，7 d左右可見長(zhǎng)梭形細(xì)胞密度達(dá)70%，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，SM α-actin免疫熒光鑒定VSMCs，取P3-P8代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液。以1×105/mL密度接種到96孔板中，每孔200 μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度(25、50、100 μg/mL)的GSRg3。正常對(duì)照組加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，作用24 、48 h后，取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)在CO2孵箱中培養(yǎng)4 h 即有甲簪生成，棄掉上清液。每孔加入DMSO 150 μL，搖床上避光振蕩10 min，使其充分溶解，用酶標(biāo)儀于492 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。細(xì)胞增殖抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 Annexin V- FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，GSRg3(25、50、100 μg/mL)作用48 h后消化離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)1×106/mL，加入5 μL Annexin V/FITC混勻，再加入10 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè)VSMCs中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，按各分組分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定濃度。將提取的總蛋白與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混勻后變性(99 ℃，8 min)，等量上樣于10% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，然后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜電轉(zhuǎn)，5% 的脫脂牛奶封閉1 h，加入羊抗鼠一抗(Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、β-actin 1∶1 000、cleaved caspase 3 1∶1 000、cleaved caspase 9 1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，棄一抗后加HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG抗體室溫?fù)u床孵育1 h，TBST漂洗后用顯色劑ECL顯色、曝光。使用Image Pro Plus軟件測(cè)定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 如圖1所示，原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)第5～7天即可見數(shù)個(gè)細(xì)胞以垂直方向從組織塊邊緣游出，繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊周圍可見明顯的生長(zhǎng)暈，約14 d左右，生長(zhǎng)暈不斷擴(kuò)大，細(xì)胞呈典型的“峰谷”樣結(jié)構(gòu)特征。采用SM α-actin進(jìn)行鑒定，綠色為SM α-actin特異性染色，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色。

圖1 VSMCs的培養(yǎng)及免疫熒光鑒定

2.2 GSRg3可抑制VSMCs增殖 不同分組的VSMCs加入不同濃度的GSRg3處理，然后置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在相差顯微鏡下觀察VSMCs的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)變化。結(jié)果如圖2所示，正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，隨著GSRg3濃度由25 μg/mL增加至100 μg/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞間連接減少，且隨著GSRg3濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)活性受影響越明顯。

圖2 不同濃度GSRg3干預(yù)24 h后VSMCs的形態(tài)變化

同時(shí)MTT比色法結(jié)果顯示(見表1)，GSRg3抑制VSMCs的增殖，且隨著Rg3濃度及作用時(shí)間的增加，抑制增殖的能力逐漸增強(qiáng)。

表1 GSRg3對(duì)VSMCs的增殖抑制率

2.3 GSRg3誘導(dǎo) VSMCs細(xì)胞凋亡 Annexin V- FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(見圖3)，GSRg3作用于VSMCs 48 h，正常對(duì)照組、25 μg/mL GSRg3組、50 μg/mL GSRg3組、100 μg/mL GSRg 3組VSMCs總體凋亡率(早凋+晚凋)分別為(6.98±0.57)%、(16.12±1.15)%、(23.89±1.14)%、(31.69±2.13)%，見圖3。提示，相對(duì)于正常對(duì)照組，加入不同濃度的GSRg3后，VSMCs凋亡率有所增加，且隨著GSRg3濃度的增加，其誘導(dǎo)VSMCs凋亡率也增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*：與對(duì)照組相比，P<0.05； n=3。圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.4 GSRg3對(duì)VSMCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步解析GSRg3促進(jìn)VSMCs凋亡的機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。由圖4可見，不同濃度的GSRg3作用于VSMCs 48 h后，相比于對(duì)照組，GSRg3能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并且呈劑量依賴，VSMCs中Bcl-2/Bax的比率明顯下調(diào)。此外，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9蛋白表達(dá)均有一定程度上調(diào)，與對(duì)照組相比，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9的表達(dá)在GSRg3 50、100μg/mL組的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

*：與對(duì)照組相比，P<0.05； n=3。圖4 不同濃度GSRg3對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)嚴(yán)重危害著人們的健康和生活質(zhì)量，PCI是臨床治療CHD的重要手段，然而，PCI會(huì)造成血管內(nèi)膜的機(jī)械損傷，最終造成RS。血管損傷后再狹窄的實(shí)質(zhì)是機(jī)體對(duì)損傷動(dòng)脈壁的過(guò)度修復(fù)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為炎癥、新生內(nèi)膜形成和血管重塑，其中血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖與遷移可能在RS中起著比較重要的作用。因此，尋求能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡的且又具有低毒性的新型藥物是非常必要的。

既往研究發(fā)現(xiàn)，GSRg3對(duì)胰腺癌[8]、胃癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]等腫瘤細(xì)胞均有一定的作用。Cho等[11]在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠中發(fā)現(xiàn)GSRg3可以通過(guò)抑制白細(xì)胞黏附血管壁而治療血管炎癥疾病，發(fā)揮血管保護(hù)作用。我們前期研究結(jié)果顯示，在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中，GSRg3能抑制頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生，但具體作用的分子機(jī)制并不清楚。本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GSRg3對(duì)大鼠VSMCs有增殖抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，GSRg3不同藥物濃度作用于VSMCs 48 h后，VSMCs中凋亡細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組，且GSRg3呈濃度依賴性，由此推斷GSRg3可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制VSMCs的活性。

細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格受到細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的自主性消亡的過(guò)程。它涉及到一系列的基因激活、表達(dá)和調(diào)控作用。目前，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要有三條：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體被認(rèn)為是處于凋亡調(diào)控的中心位置。其中，caspase 9和caspase 3為線粒體通路的主要效應(yīng)分子[12]，當(dāng)線粒體通透性增加，線粒體內(nèi)促凋亡因子如Cyt C等釋放到胞質(zhì)中，Cyt C 與凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease-activating factor,Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，通過(guò)Apaf-1 氨基端的Caspase 募集結(jié)構(gòu)域，募集胞質(zhì)中的Caspase-9 前體，并使其自我剪切活化，然后啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase 3/7，完成其相應(yīng)底物的剪切，引起細(xì)胞凋亡。我們通過(guò)GSRg3處理VSMCs后檢測(cè)cleaved caspase 3、cleaved caspase 9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cleaved caspase 9、cleaved caspase 3的表達(dá)均升高。提示GSRg3誘導(dǎo)VSMCs凋亡與線粒體通路密切相關(guān)。在該途徑中，Bcl-2家族蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)膜電位從而控制線粒體膜通透性來(lái)控制凋亡[13]。根據(jù)它們?cè)诘蛲鲋械淖饔每煞譃榇俚蛲龅鞍缀涂沟蛲龅鞍?。抗凋亡蛋白Bcl-2定位于線粒體外膜，抑制細(xì)胞色素C(Cyt C)的釋放，而含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白Bax在收到凋亡信號(hào)后，發(fā)生寡聚化，從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，引起線粒體通透性改變，跨膜電位丟失，釋放Cyt C，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，不同濃度GSRg3作用于VSMCs后，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯下調(diào)，促凋亡蛋白Bax明顯上調(diào)，提示GSRg3作用與VSMCs增強(qiáng)Bax蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，GSRg3通過(guò)促進(jìn)Bax、cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)VSMCs凋亡。