李志強(qiáng)，劉穎，林風(fēng)，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福建 福州，350007)

紅曲是以大米為主要原料，接種紅曲菌(Monascussp.)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成的紫紅色曲米，有1 000多年的歷史[1]。紅曲被廣泛用作食品著色劑、魚(yú)肉防腐劑、醋酒發(fā)酵劑以及傳統(tǒng)中藥等，是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，應(yīng)用范圍廣，開(kāi)發(fā)價(jià)值高，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[2-5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紅曲中蘊(yùn)含多種具有生物活性的物質(zhì)，如莫納可林類(lèi)、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、黃酮類(lèi)及食用色素等[5]。自ENDO(遠(yuǎn)藤章)1979年發(fā)現(xiàn)紅曲菌可以產(chǎn)生具有降血脂功能的莫納可林K(monacolin K，又名洛伐他汀)以來(lái)[6]，紅曲產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外的高度關(guān)注。然而，1995年BLANC等[7]發(fā)現(xiàn)，紫色紅曲菌和紅色紅曲菌可產(chǎn)生桔霉素(citrinin，又叫桔青霉素)，對(duì)脊椎動(dòng)物具有肝腎毒性和致癌性，因此紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品(包括紅曲)的安全性引起了人們的擔(dān)憂，限制了紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用，并已成為我國(guó)紅曲產(chǎn)品出口及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的限制性因素。因?yàn)榻勖顾貙?duì)人體的危害極大，許多國(guó)家和地區(qū)都對(duì)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品的桔霉素含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[8]。目前，我國(guó)對(duì)紅曲紅色素、紅曲黃色素和功能性紅曲米中的桔霉素做了限量規(guī)定[紅曲紅色素的限量標(biāo)準(zhǔn)為40 μg/kg(以單位色價(jià)計(jì))，紅曲黃色素的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 000 μg/kg，功能性紅曲米的限量標(biāo)準(zhǔn)為50 μg/kg][9-11]。因此篩選低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素的紅曲菌菌株成為紅曲產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)[8,12-13]。

盡管紅曲制作的歷史悠久，但我國(guó)第一個(gè)紅曲相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)直至1985年才誕生[1]。現(xiàn)階段相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)紅曲生產(chǎn)菌種的規(guī)定為：紅曲食品類(lèi)產(chǎn)品用紅曲菌屬(Monascus)的菌種即可，中藥和保健品對(duì)生產(chǎn)菌種統(tǒng)一要求用紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)[1,14]。隨著紅曲菌分類(lèi)學(xué)的研究和生產(chǎn)實(shí)踐的發(fā)展，現(xiàn)行的一些紅曲產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)紅曲菌種的規(guī)定在一定程度上影響了紅曲產(chǎn)業(yè)的更好發(fā)展。紅色紅曲菌(Monascusruber)和紫色紅曲菌均為工業(yè)上廣泛應(yīng)用的紅曲菌[5,15]，但前者不在紅曲中藥和保健品的生產(chǎn)菌種之列。本研究采用高效液相色譜法，分析比較選取的22株紅曲菌生產(chǎn)的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量，以期為紅曲中藥和保健品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)選擇11株M.purpureus和11株M.ruber，共22株。其中，福建省微生物研究所紅曲菌種資源庫(kù)10株，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心4株，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心6株，美國(guó)模式培養(yǎng)物保存庫(kù)(ATCC)2株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.4%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇和乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；H3PO4(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15 g，用于PDA斜面的制備。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO40.5，KH2PO41，NaNO33，用于紅曲菌的種子培養(yǎng)。米飯培養(yǎng)基：市售大米50 g浸泡過(guò)夜，瀝干后裝入500 mL三角瓶中，用于紅曲菌的固態(tài)發(fā)酵[12]。以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器),美國(guó)Agilent公司；Waters 2695高效液相色譜儀(配2475熒光檢測(cè)器),美國(guó)Waters公司；XA105型電子分析天平(雙量程，d=0.01 mg/0.1 mg),梅特勒-托利多公司；GR110DR型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋,廈門(mén)致微儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),Millipore公司；S1000 PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲菌株的ITS復(fù)核

對(duì)選取的菌株采用ITS測(cè)序和比對(duì)的方法進(jìn)行菌種復(fù)核。菌株的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[15]，培養(yǎng)完成后收集菌絲體用滅菌蒸餾水清洗，加入液氮研磨成粉末，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

ITS的擴(kuò)增采用引物ITS5 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS4 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[16]。PCR反應(yīng)總體積為50 μL： 10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，dNTPs(4種濃度均為2.5 mmol/L)1 μL，引物(均為10 μmol/L)各1 μL，Taq聚合酶2 U，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性樣本送測(cè)序公司用凝膠回收試劑盒回收目的片段進(jìn)行雙向測(cè)序。

甲洛洛很清楚這個(gè)撒尿的女人，她叫澤仁姆，是五個(gè)孩子的母親，至于孩子的父親是誰(shuí)，大家都不知道，或許她自己清楚吧。村里也有傳言，說(shuō)她的第四個(gè)女兒那黑森森的眼睛跟嘎絨的眼睛是一個(gè)模子里出來(lái)的，可嘎絨總會(huì)笑著說(shuō)：所有眼睛長(zhǎng)得黑森森的都是我的孩子，那我可以在村里組建一個(gè)隊(duì)伍了。

拼接測(cè)序得到的ITS序列，并根據(jù)測(cè)序圖譜人工校正堿基。采用MEGA 6.0軟件[17]對(duì)DNA序列進(jìn)行排序，并對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行校正，去除5’和3’端非對(duì)位排列區(qū)。利用MEGA 6.0軟件基于K2P (Kimura 2-parameter)模型的鄰接法(neighbour-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展1 000次估計(jì)各分支的支持率。結(jié)合形態(tài)特征和多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，BARBOSA等[18]修訂了紅曲菌的分類(lèi)系統(tǒng)，本研究主要參考該分類(lèi)系統(tǒng)。所下載的各種紅曲菌ITS 序列的GenBank登錄號(hào)為：KY635847、KY635848、KY635850、KY635851、AY498585、AY498586、JF922046、KY511726、KY511740和KY511751。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用的外類(lèi)群為黃曲霉(Aspergillusflavus) DQ683124、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)EF661568和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)HQ026746。

1.3.2 紅曲的制備

將紅曲菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基活化后參照文獻(xiàn)[12]制備種子液并進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。每個(gè)菌株做3個(gè)平行的固態(tài)發(fā)酵，未接種紅曲菌的米飯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。將固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)60 ℃干燥10 h的紅曲米粉碎(60目，粉狀)并充分混合均勻。

1.3.3 莫納可林K含量的測(cè)定

按QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》檢測(cè)紅曲中的莫納可林K含量[11]。使用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min。根據(jù)保留時(shí)間定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。自然發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中莫納可林K存在酸式和內(nèi)酯式2種構(gòu)型，這2種構(gòu)型含量之和為紅曲中莫納可林K總量。

用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇稀釋1 000 μg/mL的洛伐他汀儲(chǔ)備液至質(zhì)量濃度分別為1、10、30、75、150和400 μg/mL的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行高效液相色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)、洛伐他汀的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。R2>0.999時(shí)進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.3.4 桔霉素含量的測(cè)定

參照GB 5009.222—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定》中的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)紅曲米中的桔霉素含量[19]。使用Waters公司的2695高效液相色譜儀及2475熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm，色譜柱為C18柱 (4.6 mm× 150 mm, 3.5 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為30 μL，流速為0.7 mL/min，流動(dòng)相條件參照該標(biāo)準(zhǔn)。

用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇稀釋桔霉素儲(chǔ)備液至質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、2、5、10和50 μg/L的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。R2>0.999時(shí)測(cè)定樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌株的ITS復(fù)核

現(xiàn)階段主流觀點(diǎn)認(rèn)為紅曲菌屬共包含10個(gè)物種，因此本研究下載了10種紅曲菌模式菌株的ITS序列。利用選取的22株紅曲菌株ITS序列和下載的紅曲菌及外類(lèi)群ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

圖1 利用ITS序列基于Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree resulted from analysis of the ITS sequences using the Kimura two-parameter model

11株紅曲菌(R3、R5～R14)和M.purpureus的ITS序列完全相同，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中構(gòu)成一個(gè)單系，支持率為66%；10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)和M.ruber的ITS序列之間沒(méi)有變異，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中構(gòu)成一個(gè)單系，支持率為86%；菌株R18和M.sanguineus的ITS序列完全相同，這兩者構(gòu)成的單系支持率為99%。由于不同紅曲菌的ITS序列差異明顯，參考BARBOSA等[18]紅曲菌的分類(lèi)系統(tǒng)，11株紅曲菌(R3、R5～R14)被鑒定為M.purpureus， 10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)被鑒定為M.ruber，R18被鑒定為M.sanguineus。由于本研究的目的是比較紅色紅曲菌和紫色紅曲菌不同菌株產(chǎn)莫納可林K和桔霉素的能力，因此血紅紅曲菌的數(shù)據(jù)未納入后續(xù)分析。

2.2 紅曲中莫納可林K和桔霉素含量的測(cè)定

莫納可林K檢測(cè)的回歸方程為y=35.71x-26.47(R2=0.999 9)，莫納可林K在1～400 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。桔霉素檢測(cè)的回歸方程為y=83 477.83x-5 510.89(R2=0.999 7)，桔霉素在0.2～50 μg/L呈良好的線性關(guān)系，其檢出限為8 μg/kg。

用21株紅曲菌通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。11株紫色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲只有R5檢測(cè)到莫納可林K，其含量極低；11份紅曲中均檢測(cè)出桔霉素，只有R8的桔霉素含量(18.37 μg/kg)未超過(guò)50 μg/kg，R14的含量為377.90 μg/kg，其他9份紅曲中的桔霉素含量均>1 000 μg/kg。在10株紅色紅曲菌生產(chǎn)的紅曲中只有R22未檢測(cè)到莫納可林K，其他9株紅色紅曲菌所制紅曲中莫納可林K的含量范圍為2.67～14.20 mg/g，酸式莫納可林K的比例為49.79%～87.09%；在4份紅曲(R4、R15、R16和R17)中檢測(cè)出桔霉素，但含量均<150 μg/kg。5株紅色紅曲菌(R1、R2、R19、R20和R21)所制作的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量均符合QB/T 2447—2007《功能性紅曲米(粉)》中莫納可林K(≥4 mg/g)和桔霉素(≤50 μg/kg)的限量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 二十一株紅曲菌所制作的紅曲中莫納可林K和桔霉素的含量Table 1 Monacolin K and citrinin contents of 21 samples of red yeast rice

3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)確的物種鑒定和分類(lèi)是開(kāi)展紅曲菌其他相關(guān)生物學(xué)科學(xué)研究的基本條件。分類(lèi)學(xué)研究屬于基礎(chǔ)研究，由于紅曲菌被用于生產(chǎn)具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)藥價(jià)值的紅曲，因此，紅曲菌的分類(lèi)學(xué)研究在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中均具有重要意義。長(zhǎng)久以來(lái)研究者主要依靠形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒別紅曲菌，導(dǎo)致其菌種名稱(chēng)較混亂，因此，曾描述記載的種名有30多個(gè)[18,20-22]。這些種名主要依靠形態(tài)特征，如菌落的形態(tài)、顏色和生長(zhǎng)速度，以及菌絲、分生孢子、閉囊殼和子囊孢子的形態(tài)等命名[20]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定是開(kāi)展物種鑒定和系統(tǒng)分類(lèi)工作的重要手段，但受環(huán)境因素影響大[18,23]，存在主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性差等局限。因此利用形態(tài)特征來(lái)命名的物種需進(jìn)一步采用DNA序列驗(yàn)證。采用傳統(tǒng)分類(lèi)方法結(jié)合多個(gè)基因序列數(shù)據(jù)的分析，大多數(shù)以形態(tài)特征命名的紅曲菌被視為同種異名[18,23-24]。DNA序列數(shù)據(jù)的應(yīng)用對(duì)厘清紅曲菌的分類(lèi)發(fā)揮了積極的作用，為探明傳統(tǒng)紅曲生產(chǎn)中的菌種問(wèn)題提供了科學(xué)依據(jù)和先進(jìn)手段。所以，應(yīng)該運(yùn)用分類(lèi)學(xué)的新技術(shù)、新成果來(lái)分析紅曲生產(chǎn)中的菌種類(lèi)型、優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)中菌種的選擇和改良以提升紅曲品質(zhì)等技術(shù)問(wèn)題，促進(jìn)紅曲產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。經(jīng)過(guò)研究，工業(yè)上廣泛應(yīng)用的紅曲菌主要為紅色紅曲菌、叢毛紅曲菌(M.pilosus)和紫色紅曲菌[5,15]。但我國(guó)在制定紅曲中藥和保健品的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，選定紫色紅曲菌為唯一生產(chǎn)菌種，其理由和依據(jù)不明，且難以查證[1,14]。或許是因?yàn)楫?dāng)時(shí)可依據(jù)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)主要是關(guān)于紫色紅曲菌的，但彼時(shí)對(duì)紫色紅曲菌的研究大部分局限在色曲和釀造曲的生產(chǎn)菌種選育和發(fā)酵制作工藝等領(lǐng)域[1]，以此作為選擇高產(chǎn)莫納可林K的功能性紅曲生產(chǎn)菌種的依據(jù)不盡合理。

我國(guó)工業(yè)化生產(chǎn)的紅曲產(chǎn)品主要有3類(lèi)，即釀造用紅曲、色素紅曲和功能紅曲。紫色紅曲菌在歷史上主要用于生產(chǎn)色素紅曲，原因是這種紅曲菌色素生產(chǎn)能力強(qiáng)，但該菌也是易產(chǎn)桔霉素的紅曲菌種之一[1,14]。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)：11份由紫色紅曲菌生產(chǎn)的紅曲中均檢測(cè)出桔霉素，其中9份紅曲的桔霉素含量均>1 000 μg/kg；相比之下，在10株紅色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中有6株未檢測(cè)到桔霉素(檢出限8 μg/kg)，另外4株產(chǎn)桔霉素的能力也較弱。表明紫色紅曲菌生產(chǎn)的色曲，桔霉素超標(biāo)的幾率較大。已知桔霉素聚酮合酶基因pksCT和轉(zhuǎn)錄激活因子ctnA在桔霉素的生物合成中起作用：pksCT的缺失導(dǎo)致M.purpureusIFO 30873喪失產(chǎn)桔霉素的能力，ctnA缺失則導(dǎo)致M.purpureus桔霉素的產(chǎn)量降低至幾乎檢測(cè)不到的水平[25-26]。在CHEN等[27]的研究中，選用的4株紫色紅曲菌均具有pksCT和ctnA基因，都可產(chǎn)生桔霉素；而6株紅色紅曲菌均缺失pksCT和ctnA基因，發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素檢測(cè)也呈陰性。紅曲中藥及保健品的生產(chǎn)菌種除了考慮其安全性(桔霉素含量)外，莫納可林K的含量應(yīng)是衡量紅曲產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一，因?yàn)槟{可林K是該類(lèi)型紅曲中唯一被闡明具有降膽固醇活性的成分。且最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)莫納可林K的紅曲菌為1株分離自泰國(guó)食物的M.ruberNo.1005[6]。本研究結(jié)果表明，紫色紅曲菌產(chǎn)莫納可林K能力不如紅色紅曲菌，因此,只將紫色紅曲菌列入可用于紅曲中藥和保健食品的真菌菌種名單值得商榷[1,14]?？紤]到民間制作紅曲所用的混合菌種應(yīng)該包含了紅色紅曲菌，紅色紅曲菌也是工業(yè)中廣泛應(yīng)用的紅曲菌之一[5]，且紅色紅曲菌產(chǎn)莫納可林K的能力較強(qiáng)，低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素的幾率高，紅色紅曲菌應(yīng)該通過(guò)相應(yīng)程序在紅曲中藥和保健品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中獲得合法地位。本研究以期為將來(lái)紅曲中藥和保健品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供部分科學(xué)依據(jù)。