張宇，潘潔瓊，滿都拉，孫子羽，陳忠軍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特，010018)

食醋是我國傳統(tǒng)調(diào)味品，小米、大米、高粱等多種谷物均可作為釀醋原料。小米因氨基酸、維生素、礦物質(zhì)種類齊全，營養(yǎng)豐富的特點已成為釀造醋的優(yōu)選原料。揮發(fā)性香氣成分是反映小米醋品質(zhì)的特征性標志之一，其種類、含量及比例是影響最終風味的關(guān)鍵因素。目前通過液液萃取、蒸餾萃取以及固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)等前處理方法，已經(jīng)從食醋中鑒定出的揮發(fā)性化合物主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、雜環(huán)類等[1-3]。SPME是近年來發(fā)展起來的一種檢測食品風味物質(zhì)的新技術(shù)，常與氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)來分析和鑒定風味物質(zhì)[4-6]。徐清萍等[7]研究了全酶法液態(tài)發(fā)酵工藝在小米醋酒精發(fā)酵階段的應(yīng)用，所制備的食醋在風味及營養(yǎng)成分的含量上都很難達到固態(tài)發(fā)酵食醋的指標；于迪等[8]根據(jù)山西老陳醋的釀造工藝釀造小米醋并測定發(fā)酵過程中理化指標的變化，分析了小米醋的揮發(fā)性香氣成分。本文以小米為原料，谷糠為填充料，采用固態(tài)法釀造小米醋，對不同的發(fā)酵階段、陳釀階段及陳釀方式下的揮發(fā)性香氣成分進行了研究，為提高小米醋的風味和品質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米、谷糠,市售；安琪釀酒曲，安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌滬釀101，沂源康源生物科技有限公司；結(jié)晶酚、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸[9]、HCl、NaOH、NaCl、NaHSO3為分析純，上海化學試劑有限公司。

1.2 實驗設(shè)備

FA-1電子天平,上海菁海儀器有限公司；PHS-3C精密pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司；SIGMA 3-18KS離心機,上海創(chuàng)未生物技術(shù)有限公司；紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、手動式SPME手柄,美國賽默飛世爾科技公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 小米醋的釀造工藝[10]

1.3.2 操作要點

蒸煮：使小米蒸煮后達到熟而不黏的狀態(tài)。

降溫：蒸煮后小米攤晾至25 ℃左右。

糖化酒化階段：添加谷糠使含水量達到60%。將安琪釀酒曲在35～42 ℃的溫水中活化30 min后添加，添加量為原料的0.8%。邊糖化邊酒精發(fā)酵，待酒醅中酒精度達到8%左右結(jié)束。

醋化階段：酒醅中補加谷糠使其含水量為50%，將活性醋酸菌以原料0.15%的添加量加入進行醋酸發(fā)酵，每12 h進行一次人工翻醅來供氧及降溫，連續(xù)3 d測定總酸含量基本保持不變時發(fā)酵結(jié)束。

淋醋：醋醅用80 ℃的熱水按質(zhì)量比1∶1浸泡16 h，然后進行淋醋。

陳釀：醋醅壓實于缸內(nèi)密封保存；醋液密封后4 ℃保存。

1.3.3 理化指標的測定方法

酒精度：參照 GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》進行測定；發(fā)酵溫度：使用溫度計進行測定；還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸比色法[11]進行測定；總酸、pH：參照GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》進行測定。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

1.3.4.1 取樣

分別取酒精發(fā)酵第5、7天,醋酸發(fā)酵階段第2、5、8、10天的發(fā)酵醅；浸淋得到的新醋；陳釀1個月、2個月的醋液；陳釀1個月、2個月的醋醅。

1.3.4.2 樣品處理方法

將首次使用的固相微萃取頭在進樣口老化至無雜峰，老化溫度230 ℃，時間30 min。稱取3 g醋醅加入樣品瓶中，并加入6 mL H2O和1.5 g NaCl，置于40 ℃加熱平臺上預熱10 min(吸取稀釋20倍的醋液6 mL，放入15 mL干凈的樣品瓶中并加入1.5 g NaCl[12])，將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭并與醋液面保持1.5 cm的距離，萃取溫度40 ℃，萃取時間40 min。隨后抽回纖維頭，并將萃取頭插入氣相色譜進樣口，推出纖維頭于230 ℃解吸3 min后啟動儀器采集數(shù)據(jù)[13]。

1.3.4.3 GC-MS條件參數(shù)

色譜條件：色譜柱為 DB-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min，不分流，進樣口溫度230 ℃。柱溫：起始溫度35 ℃，以5 ℃/min的速度升至180 ℃，再以10 ℃/min的速度升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度230 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～450 u。

1.3.4.4 定性分析

數(shù)據(jù)處理:對照譜庫鑒定得到的成分，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜圖譜、保留指數(shù)和相關(guān)文獻[2,14]定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化及酒精發(fā)酵階段

2.1.1 理化指標的變化

酒精發(fā)酵階段，霉菌分泌的糖化酶將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，同時酵母菌分泌的酒化酶在無氧條件下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精[15]。如圖1所示，還原糖主要來源于原料的糖化，酒精發(fā)酵階段開始時微生物大量繁殖，糖化力增強，還原糖的含量迅速增長到最大含量。由于酒醅中酶系的積累，還原糖在多種酶的作用下逐漸轉(zhuǎn)化為酒精，導致其含量逐漸降低[16]。酒精發(fā)酵前期，作用強，乙醇和二氧化碳產(chǎn)量大，發(fā)酵酒醅酒味突出，表面氣泡明顯，糖分消耗快。在酒精發(fā)酵第2天，由于酒醅中各物質(zhì)反應(yīng)會生成乙醛，乙醛逐漸氧化成乙酸，同時酒醅中的葡萄糖部分會轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸，而且乳酸菌多樣性在酒精發(fā)酵階段逐漸增加[17]。隨著酸類物質(zhì)的增長，pH不斷降低，但在酒精發(fā)酵后期pH基本不變，并維持在4.5～5之間。酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的過程會放出少量熱量，所以整個酒精發(fā)酵過程中品溫基本維持在25～27 ℃之間。

圖1 酒精發(fā)酵階段pH、溫度、還原糖的變化Fig.1 Changes in pH，temperature and reducing sugar during alcohol fermentation

2.1.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)

小米醋釀造過程中，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的因素很多，其中酒醅的品質(zhì)及風味是最為重要的因素[18]。在糖化酒精發(fā)酵階段，通過固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)技術(shù)測定小米醋酒精發(fā)酵第5、7天，酒醅中揮發(fā)性香氣成分，如表1所示。發(fā)酵第5天，的發(fā)酵醅中共測得有35種物質(zhì)，而發(fā)酵第7天,醅中測得41種物質(zhì)，包括酯類、醇類、醛類、酸類等。

表1 酒精發(fā)酵階段揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量 單位：%Table 1 The relative contents of volatile flavor substances in alcohol fermentation stage

相比其他香氣成分，酯類物質(zhì)種類最多，其中相對含量較高的為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯等。這是因為在發(fā)酵過程中，醇類物質(zhì)與底物中的酸類物質(zhì)很快反應(yīng)后生成酯類物質(zhì)。在酒精發(fā)酵第5天測得14種脂類，相對含量為10.08%，而第7天酯類物質(zhì)增加到16種，產(chǎn)生了苯甲酸乙酯及丙酸乙酯，其相對含量增高到12.45%。醇類物質(zhì)相對含量最高，第5天酒醅中檢測出9種，而第7天共檢測出14種，其中相對含量較高的是乙醇、苯乙醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇。酒精發(fā)酵階段是酵母菌的繁殖旺盛期，發(fā)酵底物糖形成大量乙醇[19]。酒精發(fā)酵結(jié)束時乙醇的相對含量顯著增高達到64.31%，這與北京米醋的相關(guān)研究結(jié)果相似[20]。有研究表明，高級醇是酵母菌酒精發(fā)酵的正常副產(chǎn)物, 主要由正丙醇、異丁醇 (2-甲基-1-丙醇)、活性戊醇 (2-甲基-1-丁醇) 和異戊醇 (3-甲基-1-丁醇)組成[21]。酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生的高級醇相對含量在第7天降低，這可能是部分高級醇與酸類生成酯的緣故。此外，醛類物質(zhì)、酸類物質(zhì)及烷烴類物質(zhì)在酒精發(fā)酵階段均有檢出，但相對含量較小，變化不大。

2.2 醋酸發(fā)酵階段

2.2.1 理化指標的變化

醋酸發(fā)酵階段是酸性物質(zhì)形成的主要階段，谷糠作為輔料及填充料與酒醅混合形成醋醅，能為醋酸菌提供營養(yǎng)，進行大量繁殖并抑制了霉菌、酵母菌等其他微生物的生長[22-23]。如圖2所示，由于環(huán)境適宜，原料充足，醋酸菌生長旺盛，氧化一些化合物生成酸類物質(zhì)，因此總酸含量上升明顯。醋酸發(fā)酵中期，總酸含量迅速增加到6.2 g/100 mL，酸度較高可抑制微生物的生長，防止小米醋的腐敗變質(zhì)。發(fā)酵到第8天后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機酸的積累，醋酸菌等產(chǎn)酸菌代謝緩慢，總酸含量基本穩(wěn)定不變。乙醇被氧化生成乙酸的過程中會產(chǎn)生大量生化熱，導致醋醅溫度上升較快，之后通過人工翻醅降溫，緩慢的降溫過程有利于將殘余的淀粉、糖、乙醇繼續(xù)轉(zhuǎn)化，提高產(chǎn)量。pH在發(fā)酵第5天由于乙酸的生成而下降明顯，這與熊越[13]在四川麩醋的研究中情況相似。隨著發(fā)酵的進行，由于緩沖體系的形成，pH穩(wěn)定在3.65左右[24]。資料顯示[25]，pH值處于3.6～3.9對醋酸菌的生長和產(chǎn)酸有利。

圖2 醋酸發(fā)酵階段pH、溫度和總酸的變化Fig.2 Changes in pH，temperature and total acid during acetic acid fermentation

2.2.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

如表2所示，醋酸發(fā)酵階段，由于酯化反應(yīng)的進行，酯類物質(zhì)含量持續(xù)上升，到第8天時達到最大值64.83%，之后由于酯類物質(zhì)的揮發(fā)性較強，醋酸發(fā)酵結(jié)束時相對含量下降到24.33%。其中相對含量較高的酯類為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等。與酒精發(fā)酵階段相比，在醋酸菌的作用下乙醇大量轉(zhuǎn)化為乙酸以及醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，故醇類物質(zhì)相對含量持續(xù)下降。而在醋酸發(fā)酵過程中，苯乙醇的含量不斷升高，并在第8天達到最大相對含量21.15%，之后逐漸下降。這是因為苯乙醇是苯丙氨酸經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生醛，然后再還原生成的[26]。隨著醋酸發(fā)酵時間的延長，在脫氫酶的作用下醛類物質(zhì)種類及含量下降，而酸類物質(zhì)的種類及含量都有所增加，其中乙酸含量從0.54%不斷升高到50.78%。醋酸發(fā)酵過程中生成一些在酒精發(fā)酵階段未檢測到的酸類物質(zhì)如異丁酸、異戊酸、正己酸等。醋酸發(fā)酵階段，雜環(huán)類化合物種類較多,且其種類及含量在不斷變化。通過SPME-GC-MS技術(shù)測得結(jié)果中，雜環(huán)類化合物在小米醋發(fā)酵過程中相對含量較低。

表2 醋酸發(fā)酵階段揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量 單位：%Table 2 The relative content of volatile flavor substances in acetic acid fermentation stage

2.3 陳釀期揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

一般固態(tài)釀造食醋的陳釀有兩種方式，醋醅陳釀和醋液陳釀。結(jié)果如表3所示，陳釀2個月后的醋醅及醋液中酯類物質(zhì)相對含量都明顯降低，其中部分酯類物質(zhì)陳釀后消失，與熊越[13]在四川麩醋發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化研究結(jié)果相似，可能是由于酸類含量的增加造成過酸環(huán)境抑制了微生物的活性，而且酯類的分解沒有終止。分子量小、低沸點酯類化合物的芳香性較強，更具特色，而沸點較高的脂肪酸乙酯有某種耐人尋味的香氣，乙酸苯乙酯具有較好的花香和玫瑰香味[27]。本次實驗研究中乙酸苯乙酯在陳釀期先明顯增加后略有減少。陳釀后醋醅、醋液中酯類物質(zhì)含量較新醋培、新醋液分別減少了6.01%和3.68%通過陳釀后，酸類物質(zhì)的種類及含量明顯提高，這些酸可能是氨基酸降解后并經(jīng)氧化或還原生成的產(chǎn)物，也可能是飽和脂肪酸氧化降解形成的[17]。其中醋醅中酸類物質(zhì)含量在陳釀2個月后提高了12.76%，而醋液在陳釀2個月后提高了6.22%。醇類物質(zhì)種類及含量在2種陳釀方式下都明顯降低，尤其苯乙醇含量降低明顯，這與鄺格靈等[28]在研究不同陳釀期恒順香醋的風味物質(zhì)情況相符。羰基化合物是由α-酮酸經(jīng)脫碳酸而生成的醛類和脫羥基而生成的酮類構(gòu)成[22]。陳釀階段醛類和酮類的種類及含量都明顯增多，這說明大多數(shù)醛和酮是在陳釀階段產(chǎn)生的，這與黃達明等[29]在不同陳釀期鎮(zhèn)江香醋的香氣成分研究中情況相符。陳釀2個月后，正己醛、苯乙醛、苯甲醛、異戊醛、糠醛、壬醛等相對含量明顯增加，這些醛類物質(zhì)具有花香氣味，可改善食醋的品質(zhì)[30]。其中苯甲醛具有苦杏仁香味[31]，相關(guān)研究表明苯甲醛可能來自苯甲醇的氧化或者微生物對苯丙氨酸、酚類物質(zhì)以及苯乙酸和羥基苯甲酸等物質(zhì)的作用產(chǎn)生[32]。食醋中的酮類化合物主要是經(jīng)過微生物氧化、氨基酸降解以及不飽和脂肪酸的熱氧化分解而產(chǎn)生的。陳釀2個月后，3-乙酰基-2-丁酮、4-羥基-2-丁酮等出現(xiàn)并增多，這些酮類化合物一般具有甜的花香味和果香風味。醋醅陳釀2個月后醛、酮類化合物種類明顯多于陳釀醋液。其中醋醅陳釀后醛類化合物含量增加了3.62%，而醋液陳釀后醛類物質(zhì)只增加了2.65%。陳釀后雜環(huán)化合物種類及含量同樣有所增多，為小米醋提供了特有的風味[30]。

表3 陳釀期揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量 單位：%Table 3 The relative content of volatile flavors during aging

續(xù)表3

3 結(jié)論

采用固態(tài)法釀造小米醋，不同發(fā)酵階段測定理化指標，發(fā)現(xiàn)糖化及酒精發(fā)酵階段還原糖被不斷的消耗,含量降低明顯，溫度及pH呈先降低后平穩(wěn)的趨勢。醋酸發(fā)酵階段總酸含量明顯升高，溫度在發(fā)酵中期升高后降低，而pH在整個發(fā)酵過程中持續(xù)降低到3.6左右。小米醋中揮發(fā)性風味物質(zhì)種類豐富，香氣成分包括酸類、醇類、酯類，醛類、酮類和雜環(huán)類化合物，這些物質(zhì)共同決定了小米醋的風味及品質(zhì)。采用SPME-GC-MS技術(shù)分析小米醋在不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性香氣成分。結(jié)果表明，糖化及酒精發(fā)酵階段，隨著發(fā)酵時間的延長，酯類含量及種類增加，醇類物質(zhì)除乙醇含量增加外，高級醇含量有所下降。醋酸發(fā)酵階段，隨著時間的延長，風味物質(zhì)種類明顯增多，其中酯類和酸類物質(zhì)含量增加，而醇類、醛類含量有所下降，呋喃類化合物、含苯化合物、胺類化合物及其他類化合物在小米醋發(fā)酵過程中均有檢測出，但相對含量較低，對風味貢獻較少。通過陳釀，酸類物質(zhì)種類及含量明顯升高；酯類物質(zhì)雖有所減少，但其相對含量仍占較高比例，對小米醋風味貢獻較大；醛類、酮類物質(zhì)含量在陳釀2個月后明顯增加。說明通過陳釀后小米醋風味及感官有明顯提升，且醋醅陳釀方式更有利于小米醋風味物質(zhì)的提升。