王璇，歐科，馮光文，陳福欣，王婷，買(mǎi)買(mǎi)提熱夏提·買(mǎi)買(mǎi)提，錢(qián)衛(wèi)東，毛培宏*

1(新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 放射生態(tài)與離子束生物技術(shù)中心，新疆 烏魯木齊，830046)2(西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安，710054)3(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710032)

甲羥戊酸(mevalonate，MVA) 為甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVP)的中間產(chǎn)物，是酵母細(xì)胞代謝過(guò)程中一種重要的有機(jī)酸和合成具有高附加值的次生代謝產(chǎn)物的前體化合物[1-2]。甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase，MVK)是MVA代謝中關(guān)鍵催化酶和控制整個(gè)代謝途徑的限速酶之一，也是萜類和醌類物質(zhì)生物合成過(guò)程中的重要調(diào)控位點(diǎn)[3-5]。

在前期研究中利用低能離子注入介導(dǎo)藥用植物烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)基因組DNA 隨機(jī)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌，獲得了遺傳穩(wěn)定的產(chǎn)萜類和醌類化合物的重組酵母菌N6076[6-7]。本文以重組菌株N6076及其原始菌株Kh08 為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和MVA的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)定量測(cè)定，以期獲得2株酵母菌的差異表達(dá)基因的功能，并對(duì)MVK的表達(dá)與MVA的代謝進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步理解酵母菌MVA的代謝及調(diào)控提供依據(jù)，為后續(xù)的外源基因在酵母菌基因組中的整合研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N6076來(lái)源于低能氮離子注入介導(dǎo)外源DNA隨機(jī)轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeKh08獲得遺傳穩(wěn)定的重組酵母菌，由本中心保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

酵母菌株的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[8]。

用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的樣本制備及其RNA-seq方法、差異表達(dá)基因的表達(dá)量及其GO功能和KEGG代謝通路分析方法均參考文獻(xiàn)[9-10]的方法。

酵母菌胞內(nèi)MVA測(cè)定樣本的制備方法與MVA的LC-MS/MS測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因

2株酵母菌各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)及相同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因的上調(diào)和下調(diào)分析結(jié)果如圖1所示。與 0 h相比，重組菌株 N6076發(fā)酵至48和 96 h時(shí)的上調(diào)基因數(shù)量分別為 1186 和 1069個(gè)，而下調(diào)基因的數(shù)量分別為 1681和 1377個(gè)；與48 h相比，發(fā)酵至96 h時(shí)上調(diào)與下調(diào)基因數(shù)量分別為 499和291個(gè)，而原始菌株 Kh08分別為523 和588個(gè)，說(shuō)明重組菌株N6076在96 h/48 h時(shí)的基因表達(dá)的總體活躍程度低于原始菌株Kh08。

t1-處理組；t2-對(duì)照組圖1 重組酵母菌N6076 與其原始菌株Kh08不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因Fig.1 Differentially expressed genes between different time points of fermentation of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.2 差異表達(dá)基因的 GO 功能分析

使用GOSeq方法對(duì)2株酵母菌的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析結(jié)果表明，與原始菌株Kh08相比，重組菌株N6076差異表達(dá)基因的GO 功能中的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)新增14個(gè)，缺失1個(gè)；細(xì)胞組分(cellular component，CC)新增2個(gè)，缺失1個(gè)；分子功能(molecular function，MF)新增2個(gè)，缺失1個(gè)(圖2)。重組菌株N6076新增加的14個(gè)BP功能涉及213個(gè)差異表達(dá)基因(表1)，缺失的1個(gè)BP功能為NADH再生(GO:0006735)，涉及9 個(gè)差異表達(dá)基因；在CC功能方面，重組菌株N6076新增了染色質(zhì)沉默復(fù)合物(GO:0005677)和U6 snpRNP(GO:0005688)功能，分別涉及357和372 個(gè)差異表達(dá)基因；缺失的CC功能為Cul7環(huán)泛素連接酶復(fù)合物(GO:0031467)，涉及6個(gè)差異表達(dá)基因；在MF功能方面，重組菌株N6076新增了肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合(GO:0051015)和蛋白酶活性(GO:0004291)功能，分別涉及22和176個(gè)差異表達(dá)基因，缺失了1個(gè)ATP酶活性功能(GO:0016887)，涉及10個(gè)差異表達(dá)基因。

表1 重組菌株N6076新增的BP功能Table 1 New added BP functions of recombinant yeast strain N6076

圖2 重組菌株N6076與其原始菌株 Kh08差異表達(dá)基因的GO功能Fig.2 The most enriched GO Terms of differential expressed genes of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

對(duì)相同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)2株菌株的差異表達(dá)基因功能進(jìn)行分析，結(jié)果表明，發(fā)酵至48 h，2株酵母菌均包含8種上調(diào)表達(dá)基因功能，但在下調(diào)表達(dá)基因功能中，重組菌株N6076與其原始菌株Kh08分別有36和23種；發(fā)酵至96 h，2株酵母菌均包含1種上調(diào)表達(dá)基因功能(DNA ADP核糖基化)，但重組菌株N6076 未富集到下調(diào)表達(dá)差異基因，而原始菌株Kh08 的下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?NADH再生功能。

上述差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果表明，重組菌株N6076在BP、CC和MF功能方面均比原始菌株Kh08豐富，這有利于重組菌株次生代謝產(chǎn)物的合成。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，2株酵母菌的KEGG注釋信息主要包括代謝、遺傳信息過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和有機(jī)體系等功能，其中，重組菌株 N6076差異表達(dá)基因涉及111條KEGG代謝途徑，比原始菌株Kh08新增了13 條代謝途徑(表2)，涉及77個(gè)差異表達(dá)基因。

表2 重組菌株N6076新增KEGG代謝途徑Table 2 New added KEGG metabolic pathway of recombinant yeast strain N6076

萜類骨架生物合成(KEGG ID：ko00900)是重組菌株 N6076新增的一條重要的代謝途徑，為其萜類和醌類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成提供了基本的C骨架[11]。在自然界生物體內(nèi)，萜類物質(zhì)是生物次生代謝產(chǎn)物的一大類別，并且對(duì)于大多數(shù)真核細(xì)胞、少數(shù)原核細(xì)胞和高等植物而言，其MVP是合成萜類物質(zhì)的主要途徑。1958年CONRAD和 FEODOR在動(dòng)物和酵母中發(fā)現(xiàn)MVP,且此途徑主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,又稱為細(xì)胞質(zhì)途徑[12]。2分子乙酰輔酶 A 在乙酰乙酰輔酶 A 硫解酶的作用下形成乙酰乙酰輔酶 A，然后在 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 合成酶(HMGS)的作用下形成 HMG-CoA[13-14],進(jìn)而在 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶 (HMGR)的催化下形成不可逆的MVA[14-16]，NADPH 為該反應(yīng)的供氫體；MVA在MVK、磷酸甲羥戊酸激酶(MPK)作用下磷酸化，形成甲羥戊酸5-焦磷酸(MVAP)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVAPP)；最后，MVAPP在 5-焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MDC)作用下脫羧形成異戊二烯焦磷酸(IPP)，從而進(jìn)入次生代謝途徑，合成相關(guān)的萜類、醌類及甾體類物質(zhì)，與表2中的萜類骨架生物合成代謝途徑相符合。

乙酰輔酶A是MVP的前體物質(zhì)，對(duì)于萜類和醌類等次生代謝物質(zhì)的生物合成起到總量控制的作用，改變乙酰輔酶A的濃度會(huì)直接影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。近年來(lái)有研究證實(shí)，通過(guò)調(diào)控乙酰輔酶A的基因表達(dá)可以增加MVP中生成乙酰輔酶A的含量，進(jìn)而提高次生代謝物質(zhì)在目標(biāo)載體中的產(chǎn)量[17]。

原始菌株Kh08中調(diào)控乙酰輔酶A基因的表達(dá)量在0～48 h逐漸增加，48～96 h 降低。而重組菌株N6076中調(diào)控乙酰輔酶A基因的表達(dá)量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈上升態(tài)勢(shì)，其表達(dá)量在 0 h 最低，之后逐漸增加，這為其新增的萜類骨架生物合成提供了前體物質(zhì)，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成。

由于MVA的生成是一個(gè)不可逆過(guò)程，因此，HMGR (EC∶1.1.1.34)被認(rèn)為是 MVP中的第1個(gè)限速酶[18]。HMGR這個(gè)酶的基因的差異表達(dá)分析結(jié)果表明，重組菌株N6076的HMGR這個(gè)酶的基因在48～96 h的KEGG表達(dá)中呈下調(diào)趨勢(shì)，涉及差異表達(dá)基因5個(gè)；而在原始菌株Kh08的KEGG代謝途徑中未富集到相關(guān)酶基因。這進(jìn)一步表明，重組菌株N6076中MVA的代謝能力有所增強(qiáng)。

2.4 MVA代謝分析

MVK是MVP中的限速酶之一[19-20]，通過(guò)對(duì)2株酵母菌MVK基因的表達(dá)分析，獲得了MVK基因隨發(fā)酵時(shí)間的差異表達(dá)趨勢(shì)(圖3-a)。同時(shí)利用LC-MS/MS對(duì)2株酵母菌不同發(fā)酵時(shí)間的胞內(nèi)MVA進(jìn)行了定量測(cè)定，結(jié)果如圖3-b所示。

圖3 重組菌株N6076與其原始菌株Kh08各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)MK基因表達(dá)矩陣與MVA產(chǎn)量Fig.3 MK gene expression matrix and MVA yield of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08 at different fermentation time points

MVK將ATP-γ位上的一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到MVA第5位的羥基上形成MVAP，并釋放ADP[21-22]，其酶活性對(duì)次生代謝產(chǎn)物的合成速率具有重要的影響作用，并對(duì)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有重要影響[23]。重組菌株 N6076 的MVK基因表達(dá)量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈起伏上升趨勢(shì)，0～48 h降低，48～96 h逐漸增加，MVA產(chǎn)量則逐漸積累，至96 h達(dá)到峰值。原始菌株Kh08的MVK基因表達(dá)量在48～96 h達(dá)到峰值，MVA產(chǎn)量在96 h達(dá)到峰值。2株酵母菌的MVK基因表達(dá)量與MVA產(chǎn)量的變化趨勢(shì)一致。

重組菌株N6076新增1條萜類骨架生物合成途徑(表2)，勢(shì)必要消耗更多的MVA，因此，發(fā)酵48和96 h時(shí)，MVA的積累量均低于原始菌株Kh08(圖3-b)，說(shuō)明MVA的代謝速度略快于原始菌株Kh08。

3 結(jié)論

差異表達(dá)基因的分析結(jié)果表明，重組酵母菌N6076發(fā)酵至48和96 h時(shí)的上調(diào)基因數(shù)量均低于下調(diào)基因的數(shù)量；但96 h/48 h時(shí)，上調(diào)基因數(shù)量>下調(diào)基因數(shù)量。

GO功能分析結(jié)果表明，重組酵母菌N6076新增了14項(xiàng)BP功能、2項(xiàng)CC功能和2項(xiàng)MF功能，涉及1 140個(gè)差異表達(dá)基因。

KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，重組酵母菌N6076新增了13條代謝通路，涉及77個(gè)差異表達(dá)基因，其中新增的萜類骨架生物合成途徑涉及5個(gè)差異表達(dá)基因，為其萜類和醌類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成提供了基本的C骨架。

MVK基因表達(dá)與MVA測(cè)定結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中MVK基因表達(dá)量與MVA產(chǎn)量的變化趨勢(shì)一致。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)重組酵母菌N6076的基因表達(dá)與MVA代謝調(diào)控提供了依據(jù)。