王耀松，馬天怡，張唯唯，黃梅桂，應(yīng)瑞峰，胡榮蓉，唐長(zhǎng)波*

1(南京林業(yè)大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京， 210037)2(肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京， 210095)

精氨酸和賴氨酸都是具有生理活性的堿性氨基酸[1]，等電點(diǎn)分別為10.76和9.74。其來(lái)源廣泛、經(jīng)濟(jì)性高，無(wú)毒害作用，可作為添加劑加入到食品體系中[2]，以提高食品物理化學(xué)穩(wěn)定性和各類食品加工功能性。前期研究發(fā)現(xiàn)精氨酸及其鹽酸鹽是通過(guò)不同的分子機(jī)制抑制蛋白分子聚集，維系蛋白穩(wěn)定性[3-5]，而賴氨酸通過(guò)誘導(dǎo)改變蛋白構(gòu)象和帶電量[6]來(lái)抑制蛋白聚集。它的帶電狀態(tài)抑制熱誘導(dǎo)蛋白聚集，再結(jié)合其他調(diào)控(如pH)可獲得有利穩(wěn)定性的聚集體[7]。蛋白聚集現(xiàn)象在其加工過(guò)程中一直存在[8]，降低蛋白穩(wěn)定性，可能損害蛋白各類功能性。在應(yīng)用體系中，研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸、精氨酸與豬肌纖維蛋白酸性氨基酸殘基相互作用而抑制蛋白聚集、提高溶解性[9,10]，可顯著改善豬肉香腸持水性[11]。此外，賴氨酸還可以降低豬肉肌纖維凝膠蒸煮損失[12]、提高乳化香腸的物理穩(wěn)定性[13]、改善魚糜凝膠性[14]和雞肉熱穩(wěn)定性[15]。精氨酸則可提高雞肌肉的持水性[16,17]。這2種氨基酸亦可通過(guò)改變分子間作用力而改變凝膠特性和微觀結(jié)構(gòu)[18]，降解雞肌纖維蛋白亞基組分而提高雞肉的嫩度[19]，還可以通過(guò)增加靜電排斥效應(yīng)而提高雞肉香腸的乳化性[20]、質(zhì)地流變性、乳化穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)等特性[21]。

以上這些研究表明在一定的pH下，精氨酸和賴氨酸具有改造食品蛋白功能性的能力，然而研究缺少?gòu)乃嵝缘綁A性跨度、并在同體系下對(duì)蛋白功能性影響的研究。另外，不少研究也表明溫度和pH等因素[22-23]影響蛋白的聚集過(guò)程。為此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合堿性氨基酸的等電點(diǎn)因素，選擇在pH在2.0、5.2、7.59、9.74和10.76下制備熱誘導(dǎo)凝膠，探討精氨酸和賴氨酸改造乳清蛋白基質(zhì)凝膠功能性的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-精氨酸、L-賴氨酸(分析純)，上海生工生物技術(shù)有限公司；乳清蛋白WPI-90，美國(guó)加州Hilmar公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)(FE28)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DK-S26)，上海精鴻實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000C)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax?i3x)，美谷分子儀器(上海)有限公司；Zeta電位儀(Nanoplus 2)，麥克默瑞提克(上海)儀器有限公司；納米激光粒度分布儀(BT-90)，丹東百特儀器有限公司；質(zhì)構(gòu)儀(TA-XT plus)，英國(guó)Stable Micro Systems公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UVmini-1240)，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1L-精氨酸、L-賴氨酸與乳清蛋白混合溶液制備

在新鮮制備的質(zhì)量濃度120 g/L乳清蛋白溶液中分別加入不同質(zhì)量的L-精氨酸、L-賴氨酸，使氨基酸最終質(zhì)量濃度分別為1和3 g/L，充分?jǐn)嚢杈鶆颉２患尤氚被岬娜榍宓鞍兹芤簽閷?duì)照。以上5類樣品，每種分成5組，使用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液將以上每類中5組樣品的pH再分別調(diào)至2.0、5.2、7.59、9.74和10.76，放置4 ℃下備用。

1.3.2 蛋白粒徑和ζ-電位測(cè)定

根據(jù)WANG等[24]的方法略作修改。用去離子水將新鮮制備的蛋白儲(chǔ)備液均稀釋到10 g/L，測(cè)定其粒徑大小及ζ-電位。

1.3.3 紫外光譜和熒光光譜測(cè)定

根據(jù)WANG等[25-26]的方法略作修改。使用與儲(chǔ)備樣品相同pH的蒸餾水將蛋白樣品稀釋到2 g/L，再應(yīng)用超微量分光光度計(jì)測(cè)定已稀釋好的樣品在240～380 nm波長(zhǎng)下的吸光度。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀掃描上述稀釋蛋白溶液的熒光強(qiáng)度，其激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)的狹縫設(shè)置為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm，測(cè)定300～500 nm下熒光強(qiáng)度。

1.3.4L-精氨酸、L-賴氨酸清蛋白凝膠的制備

用內(nèi)徑為35 mm、高度為30 mm小燒杯加入25 mL上述不同質(zhì)量濃度的L-精氨酸、L-賴氨酸及5個(gè)pH的乳清蛋白溶液，使用保鮮膜封口；90 ℃水浴加熱30 min后取出，冰水冷卻至室溫，放置4 ℃冰箱中12 h，凝膠待用。

1.3.5 蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定凝膠質(zhì)構(gòu)特性。探頭測(cè)試前、測(cè)試及測(cè)試后的速率分別設(shè)置為1.0、2.0和5.0 mm/s；下壓距離為10.0 mm；觸發(fā)力為5.0 g；凝膠形狀為圓柱形(35 mm×30 mm)。凝膠質(zhì)地以Bourne定義[27]計(jì)算其硬度、彈性、黏聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性。

1.3.6 化學(xué)作用力測(cè)定

參照CHAWLA等[28]的方法測(cè)定0(對(duì)照組)、3 g/LL-精氨酸、L-賴氨酸/乳清蛋白混合凝膠中的化學(xué)作用力。將4種溶劑分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4，其中S1：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl；S2：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸鈉；S3：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸鈉和8 mol/L尿素；S4：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸鈉、8 mol/L尿素和體積分?jǐn)?shù)2% β-巰基乙醇。每份稱取0.2 g的凝膠，分別加入8 mL上述溶液，在室溫條件下?lián)u勻靜置過(guò)夜，采用雙縮脲法測(cè)定溶解出的蛋白質(zhì)含量，其溶解率為溶出蛋白所占凝膠塊內(nèi)總蛋白的比例(%)。

1.3.7 持水性測(cè)定

參考WANG等[29]的方法，取一定質(zhì)量的乳清蛋白凝膠置于含濾紙的離心管中，3 000×g離心20 min，再稱質(zhì)量。持水性(water holding capacity,WHC)的值按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中:m1,凝膠、離心管和濾紙質(zhì)量，g；m2,離心后去除凝膠的質(zhì)量，g；m,離心管與濾紙的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Statistix軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)為α=0.05；采用LSD檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異顯著性，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-精氨酸/L-賴氨酸誘導(dǎo)乳清蛋白粒徑大小和ζ-電位的變化

蛋白粒徑及其帶電性影響蛋白分子聚集和穩(wěn)定性，對(duì)蛋白的凝膠行為有著重要影響[30]。圖1中乳清蛋白在等電點(diǎn)(isoelectric point,pI)5.2時(shí)，其粒徑大小顯著大于其他pH條件下的粒徑尺度，平均在1 700 nm左右；在其他pH條件下，蛋白粒徑大小并不隨著pH的變化而發(fā)生顯著性改變，基本保持在380～410 nm。不同質(zhì)量濃度的L-精氨酸和L-賴氨酸的加入，未引起蛋白粒徑大小的顯著改變；然而在同一pH條件下，L-賴氨酸比L-精氨酸更能降低蛋白粒徑大小，并隨著氨基酸質(zhì)量濃度的升高而進(jìn)一步降低蛋白粒徑。對(duì)于聚集體的另一個(gè)重要參數(shù)是ζ-電位，因?yàn)榻M成聚集體的蛋白是由幾類蛋白組成，在等電點(diǎn)時(shí)聚集體僅僅帶有極少量的負(fù)電；在低于等電點(diǎn)pH時(shí)，加入氨基酸顯著提高蛋白聚集體的帶正電量(除質(zhì)量濃度3 g/LL-賴氨酸外)；在pH>等電點(diǎn)時(shí)，聚集體的蛋白帶電性為負(fù)電,帶電量顯著上升(P<0.05)。在pH 7.59下的1 g/LL-精氨酸以及在pH 9.74下的3 g/LL-精氨酸能夠顯著降低聚集體帶電量(P<0.05)，而其他pH下氨基酸的加入則對(duì)聚集體帶電量無(wú)顯著影響。為此，乳清蛋白在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)能形成較小的聚集體，顯著提高帶電性及帶電量；L-精氨酸、L-賴氨酸可進(jìn)一步降低聚集體的大小和帶電量，與之前報(bào)道一致[31]。

a-粒徑;b-ζ-電位圖1 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸對(duì)乳清蛋白粒徑大小和ζ-電位的影響Fig.1 Effect of L-Arg/L-Lys on the particle size and ζ-potential of whey protein at various pH values

2.2 L-精氨酸/L-賴氨酸誘導(dǎo)乳清蛋白結(jié)構(gòu)的變化

本試驗(yàn)利用具有芳香族氨基酸的紫外吸收光譜和熒光吸收光譜行為來(lái)反映乳清蛋白結(jié)構(gòu)變化[32]，結(jié)果如圖2所示。在同一pH條件下，乳清蛋白的紫外吸收光譜與其熒光吸收光譜的變化規(guī)律類似。在pH 2.0時(shí)，隨著L-精氨酸和L-賴氨酸添加量越大，2種光譜的吸收強(qiáng)度越大，1 g/LL-精氨酸處理樣品的光譜吸收強(qiáng)度高于3 g/LL-賴氨酸處理樣品的光譜強(qiáng)度；在pH 5.2時(shí)，樣品的2種光譜吸收強(qiáng)度卻隨著L-精氨酸、L-賴氨酸加入量的升高而降低，此時(shí)L-賴氨酸處理的乳清蛋白光譜吸收強(qiáng)度要高于L-精氨酸處理的；在堿性范圍(pH 7.59～10.76)內(nèi)，乳清蛋白的2種光譜吸收強(qiáng)度卻進(jìn)一步降低；在同一pH下，L-精氨酸處理要比L-賴氨酸處理的蛋白樣品吸收強(qiáng)度低；也就是說(shuō)，L-精氨酸可能比L-賴氨酸對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)變動(dòng)的影響大?？傊?，經(jīng)1～3 g/LL-精氨酸和L-賴氨酸處理的乳清蛋白在酸性、堿性條件下的結(jié)構(gòu)變化行為不同。

a，b-pH 2.0；c，d-pH 5.2；e，f-pH 7.59；g，h-pH 9.74；i，j-pH 10.76圖2 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸與乳清蛋白相互作用的紫外吸收光譜和熒光光譜Fig.2 Ultraviolet absorption and fluorescence spectra of the interaction between L-Arg/L-Lys and whey protein at various pH values

2.3 L-精氨酸/L-賴氨酸對(duì)乳清蛋白在不同pH下所成凝膠形貌和質(zhì)構(gòu)的影響

凝膠性是蛋白眾多功能性之一，賦予蛋白質(zhì)地并承載著蛋白其他功能性(如持水性)。由平視圖(圖3-a)和俯視圖(圖3-b)可知，在不同pH、不同質(zhì)量濃度L-精氨酸和L-賴氨酸的條件下，乳清蛋白均能形成質(zhì)構(gòu)比較完整的凝膠，并且這些凝膠在“站立”時(shí)能保持凝膠形狀而不出現(xiàn)明顯的坍塌現(xiàn)象。在pH 2.0時(shí)，處理組較對(duì)照組，蛋白所成凝膠的完整性得到顯著提高；在蛋白等電點(diǎn)處，L-賴氨酸處理的蛋白所成凝膠表面粗糙，而L-精氨酸處理組的凝膠則相對(duì)光滑、細(xì)膩。這可能是加入HCl調(diào)節(jié)pH時(shí)形成不同能力的pH緩沖對(duì)，也就是說(shuō)H+釋放速率不同，影響蛋白聚集(自組裝)速率和模式[33-34]，從而形成不同粗糙度的結(jié)構(gòu)。在pH 7.59和pH 9.74時(shí)，對(duì)照組凝膠在自身重力作用下有一定的橫向膨脹性，而處理組的凝膠均沒(méi)有明顯變化。在較高(pH 10.76)條件下，不同處理的蛋白所形成的凝膠均能完整地保持形狀。

圖3 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸加入乳清蛋白后所成熱誘導(dǎo)凝膠的形貌圖Fig.3 Visible appearance of heated whey protein gels after L-Arg and L-Lys additions formed at various pH values

此外，不同質(zhì)量濃度的L-精氨酸、L-賴氨酸處理的乳清蛋白在不同pH下所成凝膠的顏色變化呈現(xiàn)類似的規(guī)律。在乳清蛋白等電點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組與處理組的乳清蛋白所成凝膠均為白色；在酸性條件下(pH 2.0)，乳清蛋白所成凝膠顏色則為灰黃色并伴有一定的渾濁，而在堿性條件下所形成的凝膠顏色則是亮黃色，其黃度值隨著pH升高而增加，在酸性、堿性條件下形成的凝膠在顏色方面有著明顯差異。L-精氨酸、L-賴氨酸的加入對(duì)凝膠的顏色沒(méi)有顯著影響。凝膠濁度的變化可能是蛋白在酸性、堿性條件的分子排布不同，而顏色的變化可能歸結(jié)于半胱氨酸的消除反應(yīng)所形成的無(wú)機(jī)和有機(jī)聚硫化合物[35]。

凝膠的全質(zhì)構(gòu)結(jié)果如圖4所示。在pH 2.0時(shí)，所有樣品形成的凝膠強(qiáng)度均無(wú)顯著性差異，其凝膠硬度在蛋白等電點(diǎn)時(shí)都達(dá)到最大。在等電點(diǎn)處，蛋白分子因不帶電而致使在形成凝膠后缺少靜電相互作用，形成的球形聚集體有極大的斷裂脆性[36]，從而在二次下壓過(guò)程中表現(xiàn)出較差的彈性、黏聚性和回復(fù)性(圖4-b、c和f)。在低pH缺少巰基/二硫鍵交換反應(yīng)，而提高pH則能促進(jìn)這種反應(yīng)[30]。

a-硬度；b-彈性；c-黏聚性；d-膠黏性；e-咀嚼性；f-回復(fù)性圖4 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸對(duì)乳清蛋白所成凝膠質(zhì)地特性的影響Fig.4 Effect of L-Arg/L-Lys on texture of whey protein gels formed at various pH values

加入堿性氨基酸后，在等電點(diǎn)處1 g/LL-精氨酸/L-賴氨酸顯著提高凝膠強(qiáng)度(P<0.05)。隨后凝膠硬度先降低后又在pH 10.76處顯著上升(P<0.05)(圖4-a)。膠黏性與凝膠硬度的變化規(guī)律類似(圖4-d)。在等電點(diǎn)處所形成的凝膠，彈性值最低(圖4-b)，當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，凝膠彈性開始顯著提高，特別在pH 7.59和pH 9.74，1 g/LL-賴氨酸對(duì)凝膠的彈性提升最為顯著(P<0.05)。對(duì)于凝膠的黏聚性(圖4-c)，總體趨勢(shì)上其值隨著pH上升而顯著上升，特別在pH 2.0和pH 7.59時(shí)，3 g/LL-精氨酸/L-賴氨酸能夠顯著提高凝膠黏聚性(P<0.05)。凝膠的回復(fù)性(圖4-f)與凝聚性變化類似；在pH 7.59時(shí)，3 g/LL-精氨酸/L-賴氨酸處理則顯著高于其他處理組，但隨后隨著pH升高而略有下降。咀嚼性也是隨著pH的升高而升高(圖4-e)；在等電點(diǎn)、pH 7.59時(shí),L-精氨酸的加入引起咀嚼性顯著變化(P<0.05)。這2種質(zhì)量濃度的氨基酸在pH 9.74時(shí)均顯著降低凝膠的咀嚼性(與pH 7.59相比)，隨后在pH 10.76時(shí)又上升至與pH 7.59時(shí)的咀嚼性相當(dāng)。

從以上變化可知，凝膠的質(zhì)構(gòu)特性主要受制于pH變化，而L-精氨酸和L-賴氨酸在pH基礎(chǔ)上加入適當(dāng)濃度則可進(jìn)一步改善這些質(zhì)構(gòu)特性；在一些研究中認(rèn)為這主要?dú)w結(jié)于精氨酸、賴氨酸與蛋白質(zhì)殘基靜電作用而改變凝膠性能[11,16-17]。

2.4 L-精氨酸/L-賴氨酸誘導(dǎo)乳清蛋白熱凝膠內(nèi)化學(xué)作用力的變化

研究測(cè)定了疏水作用力、氫鍵和二硫鍵3種作用力，結(jié)果如圖5所示。在對(duì)照組樣品中，二硫鍵在pH 2.0～9.74形成凝膠中的作用表現(xiàn)越來(lái)越強(qiáng)；氫鍵在酸性條件下所成凝膠中的作用也較大；疏水作用力則在“極端pH”下(pH 2.0和pH 10.76)所成凝膠中的作用較大，特別是在pH 10.76時(shí)是形成凝膠中的主要作用力。

加入L-精氨酸的凝膠中，氫鍵在所有pH條件下的凝膠中都是主要作用力，二硫鍵在等電點(diǎn)(pH 5.2)及較高pH(pH 9.74和pH 10.76)下所成的凝膠中也發(fā)揮著重要作用，而疏水作用力卻隨著pH升高而一直降低且比較低，這可能與L-精氨酸促進(jìn)蛋白溶解相關(guān)[6]。除pH 2.0外的其他pH條件下，加入L-賴氨酸所成凝膠中的二硫鍵都發(fā)揮著重要作用；氫鍵僅在等電點(diǎn)和pH 7.59條件下所成凝膠中有一定的作用；而疏水作用力隨著pH升高而一直上升且作用越來(lái)越大；pH 2.0時(shí)，加入的L-賴氨酸所成凝膠中的氫鍵、疏水作用力及二硫鍵作用極小，這可能是靜電作用力在凝膠中起到主要支配作用[37]。在相同pH下，L-精氨酸的加入顯著提高凝膠中的氫鍵作用、降低二硫鍵作用(pH 7.59)以及疏水作用力(pH 10.76)，卻提高疏水作用力(pH 5.2和pH 7.59)。相比之下，L-賴氨酸的加入則提高凝膠中的疏水作用力和二硫鍵作用(除pH 2.0外)，但降低氫鍵作用(pH 2.0和pH 5.2)。

圖5 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸對(duì)乳清蛋白所成凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.5 Effect of L-Arg/L-Lys on the chemical forces involved in whey protein gels formed at various pH values

2.5 L-精氨酸/L-賴氨酸誘導(dǎo)乳清蛋白熱凝膠持水性的變化

由圖6可知，在等電點(diǎn)(pH 5.2)時(shí)，凝膠的持水性最差。因?yàn)榇藭r(shí)蛋白分子幾乎不帶電，缺少分子間的相互作用而形成的凝膠，其分子網(wǎng)絡(luò)的物理性截留水、蛋白分子與水分子間的水化作用而形成的單層或多層水的形成能力較差。在pH 2.0時(shí)，加入的L-精氨酸和L-賴氨酸將持水性從70%提高至75%左右。盡管等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)不帶電，但加入的1 g/LL-精氨酸和L-賴氨酸能夠顯著提高凝膠的持水性；而較高質(zhì)量濃度的L-精氨酸和L-賴氨酸則對(duì)此時(shí)凝膠的持水性無(wú)任何作用。在pH 7.59時(shí)，加入L-精氨酸和L-賴氨酸，無(wú)論質(zhì)量濃度高低均能顯著提高凝膠的持水性，達(dá)82%左右(P<0.05)。在pH 9.74時(shí)，L-賴氨酸處理使凝膠持水性開始顯著下降(與pH 7.59相比)，而L-精氨酸處理的凝膠持水性保持穩(wěn)定(相比對(duì)照組則顯著提高凝膠持水性)。在pH 10.76時(shí)，除添加3 g/LL-精氨酸顯著高于同pH下其他凝膠的持水性外，這些處理及對(duì)照組凝膠的持水性與pH 9.74時(shí)L-精氨酸處理相當(dāng)。加入堿性氨基酸后凝膠持水性有所提高，在肌球蛋白凝膠體系中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，其主要原因是堿性氨基酸抑制蛋白聚集、促進(jìn)其溶解而增大比表面積和水化能力[6,10,12,18]。

圖6 不同pH下L-精氨酸/L-賴氨酸對(duì)對(duì)乳清蛋白所成凝膠持水性的影響Fig.6 Effect of L-Arg/L-Lys on water holding capacity of whey protein gels formed at various pH values

3 結(jié)論

向乳清蛋白中加入L-精氨酸和L-賴氨酸并結(jié)合不同pH處理，可形成多功能性、顏色不同的熱誘導(dǎo)凝膠。L-精氨酸/L-賴氨酸在pH對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)與功能性改變的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步通過(guò)降低蛋白粒徑大小、改變?chǔ)?電位，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)伸展性和分子聚集行為，重排凝膠中蛋白分子間的化學(xué)作用力，顯著提高蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和持水性。在極酸條件下形成外觀不完整的濁黃色凝膠，而在堿性條件下形成外觀完整的亮黃色凝膠，并且黃度顏色隨pH升高而明顯增加；在蛋白等電點(diǎn)時(shí),蛋白形成外觀完整的乳白色、有析水現(xiàn)象的凝膠；加入L-精氨酸/L-賴氨酸可提高凝膠的外觀完整性，但對(duì)其顏色無(wú)顯著影響。為作為蛋白凝膠功能修飾的添加劑應(yīng)用在食品體系中提供理論依據(jù)。