張泗揚(yáng)，徐勇

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

前列腺癌是歐美男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤首位，死亡率僅次于肺癌[1]，同時(shí)也是最常見(jiàn)的引起男性與癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。近年來(lái)隨著普查手段及健康體檢技術(shù)的普及，前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[3]。據(jù)報(bào)道，HP1α是一種在細(xì)胞核內(nèi)介導(dǎo)癌癥相關(guān)過(guò)程的蛋白質(zhì)，它參與基因沉默的表觀遺傳調(diào)控[4]。然而，最近有研究證實(shí)，HP1α在細(xì)胞分化過(guò)程中也能激活基因表達(dá)并參與染色質(zhì)堆積和表觀遺傳的基因調(diào)控[5-6]。HP1蛋白在人類(lèi)男性前列腺發(fā)育過(guò)程中存在差異性調(diào)節(jié)[7]。有研究表明，HP1α是AR共激活因子，在AR信號(hào)的反式激活中起關(guān)鍵作用，并能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖[8]。目前有研究表明，胃癌中HP1α表達(dá)上調(diào)，且HP1α的表達(dá)與miR-758-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-758-3p通過(guò)靶向HP1α的表達(dá)來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞的行為[9]。有報(bào)道稱(chēng)HP1α和HP1β已被證明與組織特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD相互作用，并抑制其轉(zhuǎn)錄活性和肌肉末端分化[10]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是前列腺癌的侵襲和遷移中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，這一概念是Greenberg[11]在1982年提出的，他發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞在膠原凝膠中可以形成偽足，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。其后陸續(xù)有報(bào)道很多物種的原腸胚形成、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移形成神經(jīng)管，心瓣膜、顱面結(jié)構(gòu)以及肌肉骨骼系統(tǒng)的形成都有賴(lài)于EMT[12]。近年來(lái)，EMT在前列腺癌中的研究越來(lái)越多，同時(shí)其作為一種新的理念來(lái)詮釋前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為而受到廣泛關(guān)注。在前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程中，通過(guò)與周?chē)h(huán)境發(fā)生作用，然后經(jīng)過(guò)EMT使細(xì)胞極性發(fā)生改變，由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞更容易向骨骼、腦等遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化可以影響腫瘤的性質(zhì)[13]，此外，EMT相關(guān)因子還可通過(guò)金屬蛋白酶破壞基底膜促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力[14]。神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌（NEPC）是一種目前無(wú)法治愈的致死性前列腺癌亞型，可在持續(xù)的激素治療后發(fā)展而來(lái)。不幸的是，針對(duì)NEPC可用的治療方案很少，迫切需要更有效的治療方案來(lái)應(yīng)對(duì)。前列腺癌轉(zhuǎn)移性疾病是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，EMT在轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌（mCRPC）的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)的溫哥華前列腺中心的王玉琢教授所領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)，開(kāi)發(fā)了最新NEPC臨床前期模型（PDX模型）[16]，為研究NEPC的進(jìn)展提供了前所未有的準(zhǔn)確性。使用該模型和先進(jìn)的基因表達(dá)分析方法，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)HP1α在NEPC發(fā)生、發(fā)展的早期就已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)，且在NEPC發(fā)展過(guò)程中持續(xù)升高。該團(tuán)隊(duì)后又證實(shí)在NCI-H660 NEPC細(xì)胞中沉默HP1α后，可抑制增殖，抑制集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)停滯。鑒于HP1α在前列腺癌中鮮有報(bào)道，并在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，本研究擬將其作為前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及組織 人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2、PC3、DU145和良性前列腺增生細(xì)胞系BHP-1均由天津市泌尿外科研究所凍存、復(fù)蘇培養(yǎng)，LNCaP和C4-2為依賴(lài)雄激素的前列腺癌細(xì)胞系，PC3是不依賴(lài)雄激素的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，DU145則是不依賴(lài)雄激素的前列腺癌腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，BPH-1是良性前列腺增生細(xì)胞。采用含10%的胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)各細(xì)胞系。征得天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意后，在醫(yī)院病理科收集2015—2018年的前列腺癌組織和前列腺增生組織的病例蠟塊各38例，將蠟塊重新切片后進(jìn)行免疫組化染色（IHC）處理。病理組織納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）前列腺癌病理蠟塊：患者首先行前列腺穿刺活檢術(shù)，然后確診前列腺癌，同時(shí)術(shù)前、術(shù)后均未行任何形式的內(nèi)分泌、放化療等其他治療，并且前列腺癌患者自身無(wú)其他腫瘤患病史，術(shù)后的大病理也同樣是前列腺癌。（2）良性前列腺增生病理蠟塊：患者首先行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)，術(shù)后確診為良性前列腺增生。病理組織出現(xiàn)以下情況將不會(huì)采納：（1）前列腺癌患者同時(shí)患有其他腫瘤。（2）良性前列腺增生的患者同時(shí)伴有前列腺上皮內(nèi)瘤變。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 每張切片厚度為4 μm，脫蠟后將切片放于0.01 mol/L的pH為6.0～6.5的枸櫞酸鹽中，然后將切片放進(jìn)微波爐中高火加熱8 min進(jìn)行抗原修復(fù)。再使用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，使用正常山羊血清工作液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，滴加稀釋好的HP1α（1:100）抗體，4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15 min，用PBS洗后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈卵白素，室溫孵育15 min，DAB顯色及蘇木素復(fù)染，最后脫水封片。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 實(shí)驗(yàn)首先使用HP1α的特異性siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3進(jìn)行敲低處理，然后使用TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA）從前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的si-NC組和si-HP1α組中分別提取總RNA，再使用Hi－FiScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將配好的試劑置于反轉(zhuǎn)錄機(jī)器中，設(shè)定參數(shù)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將配制好的混合液體，用無(wú)酶槍頭加入48孔板，再放入已經(jīng)提前預(yù)熱好的qPCR機(jī)器中，設(shè)定參數(shù)，觀察qPCR的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最后用GraphPad軟件進(jìn)行柱狀圖量化分析結(jié)果。

1.4 Western印跡實(shí)驗(yàn) 首先使用HP1α的特異性siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3進(jìn)行敲低處理，然后對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的si-NC組和si-HP1α組分別進(jìn)行貼壁細(xì)胞總蛋白的提取，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶進(jìn)行成像處理。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA設(shè)計(jì)HP1α的特異性siRNA對(duì)HP1α進(jìn)行敲低，首先進(jìn)行細(xì)胞6孔板鋪板，次日顯微鏡下觀察6孔板中細(xì)胞是否鋪勻，細(xì)胞量達(dá)到50%左右，將羅氏轉(zhuǎn)染試劑與針對(duì)HP1α的特異性siRNA以1∶2的比例配比，然后用無(wú)菌的Optim轉(zhuǎn)染溶液定容到515 mL，并且加入到一個(gè)孔中，并加入無(wú)雙抗的培養(yǎng)基定容到2 mL。輕輕震蕩6孔板并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6 h后進(jìn)行換液處理。將混有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液吸出，并添加新的完全培養(yǎng)基，再將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行正常培養(yǎng)即可。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)48 h，就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞蛋白以及RNA提取和進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)行為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖采用CCK-8試劑進(jìn)行檢測(cè)，首先使用HP1α的特異性siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3進(jìn)行敲低處理，然后將前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的si-NC組和si-HP1α組細(xì)胞分別進(jìn)行鋪板，每組6孔，饑餓過(guò)夜，然后采用10%血清培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于接種24、48、72 h后在450 nm進(jìn)行吸光度檢測(cè)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 集落形成實(shí)驗(yàn) 首先使用HP1α的特異性siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3進(jìn)行敲低處理，然后將前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的si-NC組和si-HP1α組的細(xì)胞懸液反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分分散，細(xì)胞記數(shù)，并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，按照每皿含50、100、200個(gè)細(xì)胞的濃度分別接種5 mL細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)皿置37℃、5%CO2中培養(yǎng)2～3周，中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心浸洗2次。甲醇固定15 min，棄甲醇后用DAPI染液染色10 min，PBS緩慢洗去染液，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 首先使用HP1α的特異性siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3進(jìn)行敲低處理，然后采用孔徑為8.0 μm的transwell小室，對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的si-NC組和si-HP1α組的細(xì)胞分別進(jìn)行體外遷移和侵襲測(cè)定。進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，將密度為6×104/200 μL的細(xì)胞接種在無(wú)血清培養(yǎng)基中，在室加入50 μL的基質(zhì)膠，而600 μL含有10%血清的1640培養(yǎng)基加入下腔室。24 h后，對(duì)通過(guò)膜的細(xì)胞用DAPI染色，并在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并做統(tǒng)計(jì)分析[17]。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，除了不加入基質(zhì)膠外，操作流程與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22用于統(tǒng)計(jì)分析。研究中所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。所有數(shù)據(jù)均表示為x±s。選用t檢驗(yàn)用于比較兩組之間的差異。多組樣本均數(shù)的比較采用One-way ANOVA（單因素方差分析），P＜0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示HP1α在前列腺癌樣本中的表達(dá)高于正常前列腺 為了明確HP1α是否對(duì)前列腺癌的發(fā)生或發(fā)展產(chǎn)生影響，首先使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HP1α在前列腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果證實(shí)HP1α在前列腺癌樣本中的表達(dá)高于正常前列腺樣本（圖1A），且HP1α與前列腺癌的無(wú)疾病生存期密切相關(guān)（圖1B），結(jié)果顯示，HP1α的表達(dá)越高，前列腺癌患者的無(wú)疾病生存期越短（P＜0.05），而HP1α的表達(dá)水平與患者總生存期不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖 1C）。

圖1 HP1α的表達(dá)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的情況Fig 1 Expression of HP1α in the TCGA database

圖2 IHC和Western印跡驗(yàn)證HP1α的表達(dá)Fig 2 IHC and Western blot verified the expression of HP1α

2.2 IHC驗(yàn)證生物信息學(xué)的分析結(jié)果 為了檢驗(yàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)38例前列腺癌和良性前列腺增生的病理組織切片進(jìn)行IHC染色分析，發(fā)現(xiàn)相較于良性前列腺增生組織，前列腺癌病理組織切片中HP1α的表達(dá)陽(yáng)性率顯著增加，如圖2A所示。然后對(duì)前列腺癌和良性前列腺增生組織提取蛋白進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HP1α的表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)在前列腺癌組織中HP1α的表達(dá)高于前列腺增生組織（圖2B）。

2.3 HP1α在4種前列腺癌細(xì)胞系中高表達(dá) 為了進(jìn)一步了解HP1α在前列腺癌中的作用，選用了4種不同的前列腺癌細(xì)胞系（LNCaP、DU145、PC3、C4-2）和一種良性前列腺增生細(xì)胞系（BPH-1）來(lái)驗(yàn)證它的表達(dá)水平。結(jié)果表明HP1α在C4-2和LNCaP中表達(dá)量均較高，PC3和DU145次之，而在良性前列腺增生細(xì)胞中表達(dá)量最低（圖3）。

2.4 驗(yàn)證特異性siRNA對(duì)HP1α的敲低效率 由于遷移和侵襲是研究中一項(xiàng)重要的觀察指標(biāo)，考慮到LNCaP是前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移類(lèi)型的細(xì)胞，PC3是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移類(lèi)型的細(xì)胞，且這兩種細(xì)胞系表達(dá)量均較高，故選擇LNCaP和PC3作為主要的細(xì)胞系進(jìn)行研究。使用特異性siRNA分別在LNCaP和PC3細(xì)胞系中對(duì)HP1α進(jìn)行敲低，并且在蛋白水平及mRNA水平上分別檢測(cè)敲低效率。結(jié)果表明，在LNCaP和PC3這兩種細(xì)胞系中，HP1α均達(dá)到理想的敲低效果（圖4）。

圖3 HP1α在4種前列腺癌細(xì)胞系和良性前列腺增生細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 3 Expression of HP1α in four prostate cancer cell lines and benign prostatic hyperplasia cell lines

圖4 特異性siRNA對(duì)HP1α的敲低效率Fig 4 The knockdown efficiency of HP1α siRNA

2.5 敲低HP1α能夠有效抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 選用Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察HP1α被敲低后的前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而評(píng)價(jià)HP1α的生物學(xué)功能。Transwell結(jié)果表明，HP1α被敲低的LNCaP和PC3細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低（圖5）。

2.6 敲低HP1α能夠有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖 采用CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，首先選用LNCaP和PC3細(xì)胞系敲低HP1α，分別在24、48及72 h通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組（si-HP1α）細(xì)胞的增殖相較于對(duì)照組（si-NC）逐漸減弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LNCaP和PC3細(xì)胞系在HP1α敲低后其增殖能力明顯減低。之后又采用集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)再次驗(yàn)證敲低HP1α對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，敲低HP1α后LNCaP和PC3細(xì)胞的增殖能力顯著降低（圖6）。

圖5 敲低HP1α后前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的遷移和侵襲能力的改變Fig 5 Changes in LNCaP and PC3 cell migration and invasion capacity after knockdown of HP1α

圖6 HP1α敲低后前列腺癌細(xì)胞增殖能力的改變Fig 6 Changes in cell proliferation after HP1α knockdown

2.7 HP1α促進(jìn)前列腺癌的EMT能力 EMT在前列腺癌的遷移和侵襲中起到重要的作用，選擇E-cadherin、N-cadherin、Vimentin（波形蛋白）、Twist1、Snail1和Zeb1來(lái)作為EMT的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Western印跡結(jié)果顯示PC3和LNCaP細(xì)胞中HP1α被敲低后E-cadherin的表達(dá)增加，而其余指標(biāo)均明顯降低（圖7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低HP1α能夠減弱前列腺癌的EMT能力。

圖7 HP1α對(duì)前列腺癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的影響Fig 7 Effects of HP1α on the epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer

3 討論

前列腺癌在最初階段的癥狀比較隱蔽，隨著時(shí)間的推移逐漸發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌并多伴轉(zhuǎn)移癌，此時(shí)前列腺癌的治療手段就相對(duì)較少，患者的生存期也會(huì)受到極大影響。因此，對(duì)于前列腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究迫在眉睫，需要全力研究探索，旨在找到前列腺癌的治療靶點(diǎn)，為前列腺癌的治療提供新的方向。本研究中HP1α在很多腫瘤中都扮演著很重要的作用，是一種普遍存在的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增殖[18]、凋亡[19]和興奮性毒性神經(jīng)變性[20]等細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)。需要指出的是，有研究已表明mH2A1.2能夠直接與HP1α相互作用，使前列腺癌細(xì)胞中的LTβ基因失活[21]。

基于以上的分析，考察了HP1α對(duì)前列腺癌細(xì)胞系（C4-2、LNCaP、PC 以及 DU145）增殖的影響。從當(dāng)前的研究來(lái)看，HP1α在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)高于良性前列腺增生細(xì)胞系，除此之外，筆者還注意到HP1α在C4-2和LNCaP中高度表達(dá)。當(dāng)在LNCaP和PC3細(xì)胞系中敲低HP1α?xí)r，發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞系的遷移、侵襲和增殖能力均發(fā)生降低。而在HP1α被敲低后，E-cadherin的表達(dá)增加，其他EMT檢測(cè)指標(biāo)N-cadherin、Vimentin（波形蛋白）、Twist1、Snail1和Zeb1均明顯降低。然而，關(guān)于HP1α具體影響前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

總體來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)證實(shí)了HP1α在C4-2、LNCaP、PC3和DU145前列腺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)，在一定程度上可以促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展，并能增強(qiáng)前列腺癌的EMT能力，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，HP1α可以為提高臨床病例診斷水平和為前列腺癌腫瘤靶向治療提供新思路。