胡睿，張威，歐寧?kù)o，梁震，楊永姣，劉莉，劉曉強(qiáng)

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

糖尿病是人類常見(jiàn)的慢性疾病，我國(guó)成年人的糖尿病發(fā)病率約為10.9%，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)2025年全世界的糖尿病人數(shù)將達(dá)到3.0億左右，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)2035年全世界的糖尿病人數(shù)可能增至5.9億，2045年約為6.9億，糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-4]。糖尿病嚴(yán)重影響機(jī)體代謝，并導(dǎo)致神經(jīng)血管功能損害，進(jìn)而出現(xiàn)多種并發(fā)癥[5]。糖尿病的血管并發(fā)癥主要包括糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病下肢缺血及糖尿病性心臟病等，血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥治療和預(yù)防的關(guān)鍵[6-7]。糖尿病性勃起功能障礙（DMED）是一種常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，其在30歲男性糖尿病患者中的發(fā)病率約為15%，而在60歲男性糖尿病患者中上升至55%，高達(dá)75%的男性糖尿病患者受到DMED的影響[8]。多項(xiàng)研究表明，鏈脲佐菌素（STZ）可用于建立糖尿病大鼠模型，大鼠成模后8周可發(fā)生勃起功能障礙（ED），控制血糖可能通過(guò)改善血管內(nèi)皮功能障礙,從而治療DMED[9-11]。但是，胰島素改善DMED大鼠血管內(nèi)皮功能障礙的具體機(jī)制尚未闡明，還需要進(jìn)一步探索。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成的關(guān)鍵酶，后者在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要因子[12]。eNOS還具有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血管平滑肌功能及抑制氧化應(yīng)激等作用[13-14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，在組織缺血、缺氧狀態(tài)下發(fā)揮促血管生成作用，是最有效的促血管生成因子之一[15]。Micro RNA（miRNA）是一種由18～22個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA分子，通過(guò)與mRNA的3′-UTR結(jié)合，對(duì)mRNA進(jìn)行降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、凋亡等過(guò)程[16]。miRNA-126（miR-126）在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，具有調(diào)控黏附分子表達(dá)、血管炎性反應(yīng)、新生血管生成及維持血管結(jié)構(gòu)完整的功能[17-18]。本研究采用胰島素治療糖尿病大鼠，觀察治療后糖尿病大鼠勃起功能的變化，比較大鼠陰莖海綿體中eNOS、VEGF及miR-126含量的差異，探究胰島素治療改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)而治療DMED的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SD雄性大鼠30只，體重（280±25）g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物批號(hào)：1100111911034970。交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)勃起功能正常。所有大鼠在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度15～25℃，12 h光亮，12 h黑暗，自由進(jìn)食及飲水。

1.2 主要儀器與試劑 STZ（Sigma），檸檬酸鈉（Sigma），檸檬酸（Sigma），血糖試紙及血糖儀（羅氏公司），多聚甲醛（Sigma），兔抗大鼠VEGF抗體（Boster），兔抗大鼠 eNOS 抗體（BIOSS），小鼠單抗β-actin（武漢博士德生物工程有限公司），HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS，武漢博士德生物工程有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI），電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠），酶標(biāo)儀（Thermo），MedLab多通道生理記錄儀（南京美易有限公司）。

1.3 建立糖尿病動(dòng)物模型 30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取20只建立糖尿病模型，剩余10只作為對(duì)照組（NC組）。禁食24 h后，按45 mg/kg左下腹腔單劑量注射STZ，72 h后測(cè)定尾靜脈血糖，將血糖＞16.7 mmol/L的大鼠確定為糖尿病大鼠。一共18只大鼠成模，成模率為90%。NC組同法注射等劑量0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，72 h后測(cè)血糖均正常。將成模大鼠隨機(jī)分成糖尿病（DM組，n=9）和胰島素組（Insulin組，n=9），Insulin組每日皮下注射1次長(zhǎng)效胰島素（諾和諾德公司），劑量為（10~20）U/kg，每日測(cè)量血糖，DM組同法注射等劑量PBS。NC組和DM組每周測(cè)1次血糖，所有大鼠每周測(cè)1次體重。

1.4 測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）與平均頸動(dòng)脈壓（MAP） 各組大鼠在胰島素治療8周后進(jìn)行勃起功能檢測(cè)，將大鼠腹腔注射戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉并固定。作腹部正中切口，顯露前列腺，于前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)后，將盆神經(jīng)及陰莖海綿體神經(jīng)分離出來(lái)。切開陰莖皮膚，暴露陰莖腳，同時(shí)充分暴露陰莖海綿體；于陰莖海綿體中部置入一枚充滿肝素溶液的23G靜脈輸液針進(jìn)行穿刺，輸液針導(dǎo)管有回血，證明穿刺成功，固定輸液針，另一端通過(guò)壓力換能器連接MedLab多通道生理記錄儀，準(zhǔn)備測(cè)量ICP。然后游離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端并夾閉近心端后，并將充滿肝素溶液的PE-50導(dǎo)管置入頸總動(dòng)脈中，另一側(cè)通過(guò)壓力換能器連接MedLab多通道生理記錄儀，以監(jiān)測(cè)MAP。雙極不銹鋼電極勾住陰莖海綿體神經(jīng)，將刺激參數(shù)設(shè)置為5 V，25 Hz，5 ms脈沖寬度和 60 s持續(xù)時(shí)間，進(jìn)行電刺激，同時(shí)記錄ICP和MAP，并在每只大鼠中記錄最大ICP與MAP的比值（ICP/MAP）。

1.5 Western印跡檢測(cè)大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、VEGF的含量 將陰莖組織盡量剪碎，組織塊置于勻漿器中，加入裂解液進(jìn)行勻漿，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 mL離心管中，離心取上清分裝。BSA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液進(jìn)行沸水浴。配分離膠、濃縮膠，恒壓120 V電泳分離后轉(zhuǎn)膜（eNOS：200 mA、60 min；VEGF：200 mA、70 min），用含 5%脫脂奶粉的 TBST封閉，加入一抗（eNOS 1:1 000；VEGF 1:500；β-actin 1:500），4℃孵育過(guò)夜。洗去一抗，加入二抗后孵育2 h，洗去多余二抗，顯色曝光，掃描膠片，用BandScan（Glyko公司）分析膠片灰度值，結(jié)果以 eNOS/β-actin、VEGF/β-actin 進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、VEGF、miR-126的表達(dá) 所有引物均由Invierogen公司設(shè)計(jì)合成。取-80℃冰箱中保存的陰莖海綿體組織研磨至粉末后，使用TRIzoI試劑提取總 RNA，以 Oligo（dT）18 為引物，逆轉(zhuǎn)錄 mRNA為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL加入實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。eNOS、VEGF以GAPDH作為內(nèi)參校準(zhǔn)基因，miR-126以U6作為內(nèi)參校準(zhǔn)基因。采用ABI公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析，見(jiàn)表1。

1.7免疫組化檢測(cè)陰莖組織中eNOS、VEGF的表達(dá) 新鮮陰莖海綿體組織經(jīng)固定、包埋，石蠟塊連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，電陶爐加熱對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫去離子水孵育15 min，PBS沖洗3次，山羊血清室溫封閉30 min。加一抗（1:100）后于4℃濕盒中孵育過(guò)夜（15 h）；PBS沖洗切片3次，每次3 min，加二抗后室溫孵育20 min；PBS沖洗切片4次，每次3 min，加顯色劑；Harris蘇木素復(fù)染30 s～1 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來(lái)水水洗返藍(lán)；脫水，封片；顯微鏡下觀察 eNOS、VEGF的表達(dá)分布，棕黃色染色為陽(yáng)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用字2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

表2 各組大鼠血糖及體重測(cè)定結(jié)果(x±s)Tab 2 Blood glucose and body weight of rats in different groups(x±s)

2 結(jié)果

2.1 大鼠的血糖及體重變化 造模前，各組間血糖及體重?zé)o明顯差異（P＞0.05）。造模成功后（0周），DM組的血糖水平明顯高于NC組（t=-10.924，P＜0.001），Insulin組的血糖水平也明顯高于NC組（t=-21.829，P＜0.001）；DM 組的體重較 NC 組顯著降低（t=5.032，P＜0.001），Insulin 組的體重也顯著低于NC組（t=5.381，P＜0.001）。胰島素治療8周后，Insulin組的血糖水平明顯低于DM組（t=4.356，P＜0.001），但較 NC 組高（t=-51.207，P＜0.001）；而Insulin組的體重較DM組顯著增加（t=-10.481，P＜0.001），但遠(yuǎn)未達(dá)到 NC 組水平（t=7.301，P＜0.001），見(jiàn)表 2，圖 1。

2.2 ICP/MAP評(píng)價(jià)勃起功能恢復(fù) 胰島素治療8周后，DM組的ICP[（38.44±3.58）mmHg]與NC組[（84.10±3.84）mmHg]相比，顯著降低（t=26.826，P＜0.001），Insulin組的ICP[（62.78±3.63）mmHg]較DM 組顯著增加（t=-14.324，P＜0.001)，但不及 NC 組（t=12.391，P＜0.001）。Insulin組的ICP/MAP[（0.523 1±0.030 3）]明顯高于DM組[（0.320 4±0.029 6），t=-14.349，P＜0.001]，但未達(dá)到NC組水平[（0.700 8±0.032 1），t=12.364，P＜0.001]，見(jiàn)圖 2。

圖1 各組大鼠血糖及體重水平Fig 1 Bloodglucoseandbodyweightoftheratsindifferentgroups

2.3 Western印跡檢測(cè)陰莖組織中eNOS、VEGF的蛋白表達(dá)量 胰島素治療8周后，DM組eNOS蛋白表達(dá)量（0.253 0±0.028 9）與 NC組（0.8535±0.062 5）相比，顯著降低（t=6.629，P＜0.001），DM 組VEGF蛋白表達(dá)量（0.248 4±0.005 0） 較 NC組（0.398 8±0.007 3）顯著減少（t=52.055，P＜0.001）；Insulin組 eNOS蛋白表達(dá)量（0.323 8±0.012 0）與DM 組相比，顯著升高（t=-6.786，P＜0.001），VEGF 蛋白表達(dá)量也較 DM 組顯著增加（t=-21.177，P＜0.001），但均未達(dá)到NC組水平，見(jiàn)圖3。

2.4 RT-PCR 檢測(cè)陰莖組織中eNOS、VEGF、miR-126 mRNA的表達(dá)量 胰島素治療8周后，與NC組相比，DM 組 eNOS mRNA 表達(dá)量（0.697 8±0.029 7）、VEGF mRNA 表達(dá)量（0.532 7±0.032 6）、miR-126mRNA（0.507 2±0.064 2）表達(dá)量顯著降低（t=30.513、43.057、23.030，均P＜0.001）；與 DM 組相比，Insulin 組eNOS mRNA 表達(dá)量（0.812 0±0.039 0）、VEGF mRNA表達(dá)量（0.653 3±0.029 5）、miR-126 mRNA 表達(dá)量（0.760 3±0.030 8）均顯著升高（t=-6.994、-8.238、-10.665，均P＜0.001），但均未達(dá)到 NC 組水平（均P＜0.001），見(jiàn)圖 4。

圖3 各組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、VEGF蛋白的表達(dá)Fig 3 The protein expressions of eNOS and VEGF in the corpus cavernosal tissue of different groups of rats

圖4 各組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、VEGF、miR-126 mRNA的表達(dá)Fig 4 The mRNA expressions of eNOS,VEGF and miR-126 in the corpus cavernosal tissue of different groups of rats

2.5 免疫組化檢測(cè)eNOS、VEGF的表達(dá) eNOS、VEGF的表達(dá)位置主要在陰莖海綿體的海綿竇血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上（棕黃色即為陽(yáng)性表達(dá)）。eNOS、VEGF在DM組、Insulin組陰莖海綿體組織中表達(dá)水平與NC組相比均減少，而在Insulin組陰莖海綿體組織中表達(dá)水平與DM組相比增加，見(jiàn)圖5。

圖5 eNOS、VEGF在各組大鼠陰莖海綿體組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×）Fig 5 Expressions of eNOS and VEGF in the corpus cavernosal tissue of different groups of rats(Immunohistochemical staining，400×）

3 討論

陰莖勃起過(guò)程依賴于各種信號(hào)通路，其中，一氧化氮/cGMP通路是目前最為經(jīng)典、研究最為深入的分子信號(hào)通路。一氧化氮合酶（NOS）對(duì)一氧化氮的合成在陰莖勃起中起到重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，NOS 有 3 種亞型：eNOS、神經(jīng)型 NOS（nNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS），其中eNOS和 nNOS在勃起中起主要作用[19-20]。ED是指男性不能持續(xù)獲得和維持足夠的陰莖勃起以完成滿意的性生活[21]。糖尿病患者的ED發(fā)病率高達(dá)30%～70%，比非糖尿病患者高2～5倍[22]。隨著糖尿病患者年齡增長(zhǎng)和病程的延長(zhǎng)，ED發(fā)生率會(huì)明顯增加[23]。DMED的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，包括神經(jīng)血管等多方面的因素。糖尿病會(huì)引起晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在陰莖海綿體中積聚，AGEs與細(xì)胞內(nèi)的eNOS結(jié)合并且抑制其功能，從而使一氧化氮的合成下降，還會(huì)造成游離一氧化氮的滅活，導(dǎo)致陰莖勃起過(guò)程中主要神經(jīng)遞質(zhì)的缺失[24]。此外，AGEs還可沉積在陰莖海綿竇血管內(nèi)皮細(xì)胞中，增加血管通透性，損傷血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基，抑制VEGF等促血管再生因子的合成及功能[25-26]。Wang等[27]研究表明，糖尿病大鼠的ICP/MAP比正常大鼠顯著降低，陰莖組織中AGEs沉積明顯增加，但eNOS的合成顯著減少，胰島素干預(yù)能降低陰莖組織中AGEs沉積，增加eNOS的合成，改善血管內(nèi)皮功能，從而治療DMED。本研究采用注射STZ成功建立糖尿病模型，與NC組相比，DM組大鼠的血糖明顯升高，體重及ICP/MAP顯著降低，陰莖組織中eNOS的表達(dá)水平明顯減少；而胰島素治療8周后，Insulin組大鼠的上述指標(biāo)得到明顯改善，但低于NC組正常水平。說(shuō)明糖尿病可引起陰莖組織中eNOS合成減少，進(jìn)而影響一氧化氮的合成，導(dǎo)致大鼠發(fā)生DMED；胰島素治療可增加eNOS表達(dá)量，從而治療DMED，卻不能恢復(fù)大鼠的勃起功能至正常水平。

微小RNA（microRNA）是一類內(nèi)源性，長(zhǎng)度約為20個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)、RNA加工、翻譯，并可以引導(dǎo)DNA合成或基因組重排[28-29]。microRNA可通過(guò)對(duì)部分基因表達(dá)調(diào)控，作用于陰莖勃起過(guò)程中一氧化氮/cGMP、RhoA/Rho激酶等通路，參與ED的病理生理機(jī)制，microRNA的潛在作用已成為DMED的研究熱點(diǎn)[30]。miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑的幾個(gè)組成部分來(lái)維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和血管完整性[31]。本研究通過(guò)比較各組大鼠陰莖海綿體組織中VEGF、miR-126的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)DM組的miR-126表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組，胰島素治療組明顯高于DM組，miR-126可能參與調(diào)控VEGF在大鼠陰莖組織中的表達(dá)，在一氧化氮/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有重要作用。因此，miR-126與VEGF之間是否具有調(diào)控關(guān)系，該調(diào)控關(guān)系與糖尿病大鼠勃起功能、陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞功能之間，及與一氧化氮/cGMP通路之間的關(guān)系同樣需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可導(dǎo)致大鼠發(fā)生ED，胰島素治療通過(guò)增加ICP/MAP，增加陰莖組織中miR-126、VEGF及eNOS的表達(dá)水平，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，治療DMED。進(jìn)一步擬研究嚴(yán)格控制大鼠血糖及延長(zhǎng)胰島素治療時(shí)間對(duì)預(yù)防和治療DMED的作用，以及探討miR-126與eNOS、VEGF之間的關(guān)系，及其在DMED發(fā)生、發(fā)展和胰島素治療中的作用，為研究DMED防治新策略提供更加深入的分子研究基礎(chǔ)。