張寧，趙秀蘭，李勇莉，董學(xué)易，趙楠，劉鐵菊

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，天津300070）

肝癌是全球?qū)е滤劳龅牡谒拇髳盒阅[瘤，由于早期癥狀不明顯，預(yù)后普遍很差[1]。目前肝癌手術(shù)治療及靶向治療效果均不佳[2]。肝癌的高侵襲性及高轉(zhuǎn)移性為治療帶來極大困難[3]。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是CNC（Cap′n′Collar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有高度保守的堿性區(qū)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)bZip（basic regionleucine zipper）[4]。Nrf2在調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、增殖、分化及凋亡等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[5]。有研究表明，Nrf2在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[6]，并且與腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[7]。目前Nrf2與肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚未明確，與肝癌遷移侵襲關(guān)系研究又甚少。研究Nrf2與肝癌遷移侵襲之間的關(guān)系能夠?yàn)楦伟┑脑\斷、治療及預(yù)后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 所用的人肝癌細(xì)胞系Bel-7402購于美國ATCC公司，HCC-LM3購于北京協(xié)和細(xì)胞庫，293T購于上海復(fù)旦大學(xué)中山附屬醫(yī)院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Neuronbc公司，F(xiàn)BS（胎牛血清）購自美國Gibco公司。質(zhì)粒與慢病毒包裝試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司，質(zhì)粒包括 NFE2L2過表達(dá)質(zhì)粒（EX-T3128-Lv201），NFE2L2過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒（EX-NEG-Lv201）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCC-LM3在含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Bel-7402細(xì)胞使用含10%FBS、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞均在37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 293T在10%滅活血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，根據(jù)慢病毒包裝說明書，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，48 h后收集病毒液，Bel-7402、HCC-LM3在10%滅活血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，病毒液與培養(yǎng)基以1:1比例加入培養(yǎng)皿中，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.3 Western印跡 細(xì)胞裂解提取蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h，加入抗體Nrf2 （1:1 000）、GAPDH （1:2 000）、MMP 2（1:500）、MMP9（1:500）后 4℃過夜，轉(zhuǎn)天恢復(fù)室溫后洗膜，加入二抗室溫?fù)u床2 h，洗膜后加入發(fā)光液，顯影照相。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后細(xì)胞融合度達(dá)到100%，使用中槍頭在每個(gè)孔正中輕劃一道線，洗掉漂浮細(xì)胞后加入含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于0、24、48 h在倒置顯微鏡下照相，觀察細(xì)胞的遷移程度并記錄。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)提前將Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基1:8比例混合，添加20 μL在Transwell小室，于細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜；24孔板內(nèi)添加500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，上室添加200 μL無血清培養(yǎng)基制成的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)目為1×105個(gè)/mL，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取下小室，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料分析采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，過表達(dá)Nrf2質(zhì)粒的HCC-LM3細(xì)胞在48 h時(shí)間點(diǎn)，傷口愈合速度增強(qiáng)（t=4.435，P＜0.05），在72 h時(shí)間點(diǎn)遷移速度也較對(duì)照組顯著增加（t=37.11，P＜0.05）；同樣，過表達(dá) Nrf2質(zhì)粒的Bel-7402肝癌細(xì)胞在24 h時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，遷移速度明顯增加（t=11.17，P＜0.05），48 h時(shí)間點(diǎn)傷口愈合速度也較對(duì)照組增加（t=10.43，P＜0.05），見圖 1。

2.2 Nrf2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Nrf2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示：在過表達(dá)Nrf2的HCC-LM3肝癌細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，穿過基質(zhì)膠及濾膜的細(xì)胞數(shù)目增加（t=3.945，P＜0.05）；同樣在過表達(dá) Nrf2的Bel-7402肝癌細(xì)胞中，穿過基質(zhì)膠及濾膜的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多（t=13.51，P＜0.05），見圖 2。

2.3 Nrf2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MMP2及MMP9表達(dá)的影響 進(jìn)一步通過Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染Nrf2質(zhì)粒后的HCC-LM3與Bel-7402肝癌細(xì)胞中與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在過表達(dá)Nrf2的HCC-LM3細(xì)胞中，MMP2及MMP9表達(dá)量均增加（t=2.879，P＜0.05；t=5.582，P＜0.05）；同樣，在過表達(dá)Nrf2的Bel-7402細(xì)胞中，MMP2及MMP9的表達(dá)量也相對(duì)增加（t=3.756，P＜0.05；t=2.968，P＜0.05），見圖 3。

圖1 過表達(dá)Nrf2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig 1 Effects of Nrf2 on the migration in HCC-LM3 and Bel-7402 cells

2.4 Nrf2表達(dá)對(duì)肝癌患者生存時(shí)間的影響 對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫中具有臨床資料的400例肝癌患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Nrf2高表達(dá)肝癌患者的平均生存時(shí)間短于Nrf2低表達(dá)的肝癌患者（Logrank P=0.042），見圖 4。

圖2 Nrf2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 2 EffectsofNrf2ontheinvasioninHCC-LM3andBel-7402cells

圖3 肝癌細(xì)胞Nrf2過表達(dá)后MMP2及MMP9的表達(dá)變化Fig 3 Expression of MMP9 in HCC-LM3 and Ble-7402 cells after transfection with overexpression plasmid of Nrf2

圖4 Nrf2的表達(dá)與肝癌患者生存時(shí)間的關(guān)系Fig 4 Relationship between the expression of Nrf2 and survival time of patients with hepatocellular carcinoma

3 討論

中國肝癌發(fā)生率居世界前列，全球范圍內(nèi)中國有約一半的原發(fā)性肝癌病例，原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞肝癌、混合型肝癌及纖維板層樣肝癌，其中肝細(xì)胞肝癌占90%以上[8]。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，近年來肝癌診斷率得到增加，但臨床資料發(fā)現(xiàn)肝癌5年生存率并沒有明顯提高，這與肝癌容易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。肝癌轉(zhuǎn)移使患者失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，放化療后容易復(fù)發(fā)，死亡率極高[9-10]。研究與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點(diǎn)對(duì)肝癌診斷與干預(yù)具有臨床指導(dǎo)意義。

Nrf2在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，研究表明Nrf2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。大量實(shí)驗(yàn)證明，Nrf2通過調(diào)控多種信號(hào)途徑參與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種行為。例如Nrf2通過調(diào)控Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)肝癌遷移侵襲能力[12]。在乳腺癌中，Nrf2通過結(jié)合雌激素受體相關(guān)受體（estrogen receptor-related receptor 1,ERR1）基因啟動(dòng)子序列，抑制ERR1基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少RhoA蛋白降解，RhoA能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲及增殖能力[13]。Nrf2也能抑制腫瘤細(xì)胞E-cadherin表達(dá)，同時(shí)上調(diào)N-cadherin表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞喪失上皮特性向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力也隨之增加[14]。Nrf2基因敲除能夠抑制小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及增殖[15]。Nrf2能夠啟動(dòng)p62基因的轉(zhuǎn)錄，并形成正反饋共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[16]。此外，惡性腫瘤中如肝癌[17]、肺癌[18]、乳腺癌[19]等Nrf2高表達(dá)提示患者預(yù)后較差，并且Nrf2表達(dá)增加能作為腫瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究中，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)均表明Nrf2過表達(dá)促進(jìn)了人肝癌細(xì)胞系在體外遷移運(yùn)動(dòng)及侵襲能力，提示Nrf2表達(dá)可能在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步對(duì)公共數(shù)據(jù)庫400例肝癌患者臨床資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Nrf2高表達(dá)的肝癌患者生存時(shí)間普遍短于Nrf2低表達(dá)的肝癌患者，說明Nrf2表達(dá)與肝癌患者預(yù)后具有相關(guān)性。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移侵襲離不開細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜的蛋白降解，MMP是一種細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴性蛋白水解酶，在癌癥侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。MMP2與MMP9均是MMP家族中的重要成員，在機(jī)體中參與新生血管生成、組織修復(fù)等過程[21]。研究表明，多種惡性腫瘤如肝癌[22]、乳腺癌[23]、黑色素瘤[24]等能通過增加MMP2及MMP9外分泌促進(jìn)腫瘤遷移及侵襲能力。MMP2與MMP9表達(dá)不僅參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，也與惡性腫瘤患者的低生存率密切相關(guān)[25-26]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Nrf2通過調(diào)控其下游靶基因血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）的轉(zhuǎn)錄，間接誘導(dǎo)MMP2表達(dá)增加，從而進(jìn)一步促進(jìn)惡性腫瘤的遷移侵襲能力[27]。在肝癌與膠質(zhì)瘤中，Nrf2表達(dá)促進(jìn)MMP2或MMP9的表達(dá)水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲[28-29]。Nrf2基因敲除后發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞中MMP2的表達(dá)隨之降低，而E-cadherin表達(dá)增加，Nrf2通過促進(jìn)食管癌細(xì)胞MMP2表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步增加癌癥侵襲性[30]。本實(shí)驗(yàn)通過Western印跡證明Nrf2表達(dá)上調(diào)后肝癌細(xì)胞中MMP2與MMP9蛋白表達(dá)均顯著增加，其遷移侵襲能力明顯增加，提示Nrf2很可能通過調(diào)控MMP2與MMP9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的遷移侵襲過程。

Nrf2作為家族中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤中發(fā)揮的作用尤為重要。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Nrf2與肝癌細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)系，證明Nrf2通過調(diào)控MMP2與MMP9表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘發(fā)現(xiàn)Nrf2可能與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，但Nrf2如何調(diào)控MMP的表達(dá)尚需更進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)分析了Nrf2在體外肝癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用機(jī)制，為肝癌在轉(zhuǎn)移侵襲等生物學(xué)功能的研究及治療提供了新的見解與方向。