熊金彪，郭高超，曹藝耀，陳旨娟，黃強，楊衛(wèi)東

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，天津300052）

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）占所有膠質(zhì)瘤的60%~70%，是成人惡性程度和死亡率最高的原發(fā)性腦腫瘤[1]。過去幾十年，膠質(zhì)瘤治療技術(shù)飛速發(fā)展，主要以腦腫瘤近全切，輔以放療和（或）化療為主，盡管如此，膠質(zhì)瘤患者平均生存中位數(shù)僅約14.6個月，5年生存率僅為9.8%[2-3]。因此臨床上迫切需要一種針對GBM更有效的治療方案。

替莫唑胺（TMZ）是一種新型口服甲基化藥物，具有多種抗腫瘤效果，被廣泛用于治療GBM[4]。盡管TMZ被視為治療GBM最具前景的化療藥物，但由于耐藥性，大部分患者接受TMZ治療7個月后會出現(xiàn)GBM復(fù)發(fā)[5]。越來越多證據(jù)表明，蛋白激酶B（Akt）異常激活涉及多種類型腫瘤耐藥性[6]。并且TMZ能誘導(dǎo)Akt激活，進而降低TMZ對腫瘤細(xì)胞的毒性作用[7]。此外，最近有研究表明，核因子κ-B激酶抑制劑（IKBKE、IKKε 或 IKKi）也能誘導(dǎo)激活 Akt[8]。

Amlexanox是一種選擇性IKBKE抑制劑，被批準(zhǔn)用于口瘡潰瘍和哮喘治療[9-10]，對肥胖和2型糖尿病也有明確治療效果[11-12]。而且，有研究證明amlexanox能有效抑制GBM細(xì)胞生長[13]。因此，筆者假設(shè)amlexanox能通過抑制IKBKE而逆轉(zhuǎn)TMZ誘導(dǎo)的Akt激活，進而降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥性，增強TMZ細(xì)胞毒作用，并通過一系列體內(nèi)外實驗對該假設(shè)進行驗證。

1 材料與方法

1.1化學(xué)試劑抗IKBKE（#2690）、抗p-Akt（phospho-Ser473，#9271） 抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司?？?m-TOR（#36991）、抗 p-mTOR（phospho-Ser2448、#21214）抗體購于美國Signalway Antibody公司?？笰kt（#A18675）抗體購于美國AB－clonal公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、抗兔IgG（#ZB-2307、#ZB-2301）和 GAPDH（#TA505454）抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Amlexanox（#S364805）購于Selleck.cn中國分公司，TMZ（#IT1330）購于中國索萊寶科技公司。Amlexanox和TMZ分別溶于二甲基亞砜試劑（DMSO、#D2650，Sigma，美國），儲存于-20℃，儲存濃度分別為500mmol/L（Amlexanox）和 100 mmol/L（TMZ）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 U87 MG細(xì)胞系 該細(xì)胞系購于美國ATCC中心，于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，孵育在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。為防止細(xì)胞污染，培養(yǎng)基中混有100 U/mL青霉素/鏈霉素雙抗。

1.2.2 原代GBM細(xì)胞 術(shù)后病理證實為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅳ的新鮮腫瘤組織來源于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院手術(shù)患者。被分離新鮮組織在離體1 h內(nèi)經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，去除血跡及正常腦組織，然后經(jīng)胰酶于37℃環(huán)境中消化1 h。消化后的組織經(jīng)離心后去掉上清液，剩余沉淀培養(yǎng)于含有10%FBS的F12培養(yǎng)基（Gibco，美國）中，并加入100 U/mL青霉素/鏈霉素預(yù)防污染，孵育于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3 細(xì)胞增殖能力測定 細(xì)胞增殖能力由CCK-8實驗測定。實驗分為4組：對照組、amlexanox組、TMZ組、TMZ+amlexanox組，每組3個復(fù)孔。U87 MG和原代GBM細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、計數(shù)后接種至96孔板，每孔約 4×103細(xì)胞，于 37℃、5%CO2過夜貼壁。次日，更換含有設(shè)定濃度的單藥（TMZ或amlexanox）或聯(lián)合藥物（TMZ和amlexanox）的培養(yǎng)基。繼續(xù)于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h后，分別于每孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕柔晃動后，置于恒溫細(xì)胞箱中培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測每孔于450 nm處吸光度值，利用統(tǒng)計方法測定每組吸光度值的平均值以反映細(xì)胞增殖能力。實驗重復(fù)3次。

1.4 遷移能力測定 利用劃痕和Transwell遷移實驗檢測U87 MG和原代GBM細(xì)胞遷移能力。實驗分組同CCK-8實驗。細(xì)胞劃痕實驗過程如下：U87MG和原代GBM細(xì)胞經(jīng)設(shè)定濃度單藥或聯(lián)合藥物處理72 h后，離心、重懸，以每孔2×105細(xì)胞數(shù)接種至6孔板，于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜貼壁。至每孔單層細(xì)胞鋪滿底壁80%~90%時，用200 μL移液槍頭于每孔底壁做出十字劃痕，更換培養(yǎng)基以清除游離細(xì)胞。再于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)0、12、24 h后，用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況，每組取5個獨立劃痕視野拍照，計算劃痕愈合面積進行統(tǒng)計學(xué)分析。Transwell遷移實驗參照Liu等[13]研究。該實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 侵襲能力測定 利用Transwell侵襲實驗檢測U87 MG和原代GBM細(xì)胞侵襲能力。實驗分組同CCK-8實驗。Transwell侵襲實驗過程如下：處理后的 U87 MG 和原代 GBM 細(xì)胞（4×103）重懸于 200 μL無血清培養(yǎng)基，接種至被聚碳酸酯膜包被的Transwell小室的上室中，然后將上室置于含有700 μL 10%FBS培養(yǎng)基的下室（六孔板）中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后用棉棒擦除上室中未穿出細(xì)胞，經(jīng)4%甲醛于室溫下固定，再用0.1%結(jié)晶紫染色，流水清洗后室溫干燥，最后在顯微鏡下觀察，每個小室于10×顯微鏡下取3個獨立視野拍照，計數(shù)穿出細(xì)胞進行統(tǒng)計學(xué)分析。該實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 Western印跡實驗 U87 MG和原代GBM細(xì)胞經(jīng)設(shè)定濃度的單藥和聯(lián)合藥物處理72 h，用胰酶消化收集細(xì)胞，離心去除上清液，將沉淀于混有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解1 h?？偟鞍诐舛纫罁?jù)BCA法測定。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢（SDS-PAGE）測IKBKE及Akt通路蛋白變化，具體過程如下：取等量蛋白樣品，于6%、10%、12%的SDS-PAGE中電泳分離，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜（360 mA，60 min）。結(jié)束后，該膜經(jīng)PBS洗滌5 min×3次，洗滌結(jié)束后將膜置于5%脫脂牛奶中，于37℃恒溫箱中封閉1 h。封閉完成后，去除封閉液，用特定一抗于4℃環(huán)境中孵育過夜。次日于室溫下復(fù)溫1 h，回收一抗后，用PBS將PVDF膜洗滌5 min×3次，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫下再孵育1 h。最后丟棄二抗，用PBS再次洗滌PVDF膜后，利用ECL法測定蛋白表達(dá)水平。其中以GAPDH為內(nèi)參。

1.7 免疫組織化學(xué)染色（IHC） 裸鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，取出鼠腦標(biāo)本固定于4%福爾馬林中，石蠟包埋后做成5 μm切片。將石蠟切片置于60℃環(huán)境中烤片1 h，然后經(jīng)二甲苯和梯度乙醇水化脫蠟。結(jié)束后于92～99℃檸檬酸鈉溶液中抗原修復(fù)15 min，室溫中冷卻，然后將切片用PBS洗滌5 min×3次，再經(jīng)3%H2O2于室溫下孵育30 min以清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。結(jié)束后經(jīng)PBS洗滌5 min×3次，切片經(jīng)1%牛血清白蛋白（BSA）于37℃恒溫箱中封閉30 min，最后經(jīng)特定一抗于4℃孵育過夜。次日室溫下復(fù)溫1 h后回收一抗，PBS洗滌5 min×3次，再經(jīng)二抗孵育1 h，結(jié)束后經(jīng)DAB染色、蘇木素復(fù)染，然后分化、反藍(lán)、水化、封片。顯微鏡下觀察、拍照進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 動物實驗 本實驗利用裸鼠顱內(nèi)模型進行藥物體內(nèi)實驗。4周齡雌性裸鼠（約10 g/只）購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。顱內(nèi)裸鼠模型構(gòu)建及處理過程如下：將感染熒光病毒的原代GBM細(xì)胞用立體定向儀于裸鼠前后囟中點偏右2 mm處注射入裸鼠顱內(nèi)。7 d后，利用小動物活體成像系統(tǒng)測定裸鼠顱內(nèi)腫瘤大小，記錄數(shù)據(jù)。將裸鼠隨機分配至3組，每組15只，分別為對照組、TMZ組、TMZ+amlexanox組。TMZ組裸鼠接受5 mg/（kg·d）TMZ處理，聯(lián)合藥物組接受5 mg/（kg·d）TMZ+100 mg/（kg·d）amlexanox處理，對照組接受DMSO處理。3組裸鼠接受藥物處理5 d后休息2 d，接著再處理5 d，以此循環(huán)至實驗結(jié)束。以后每周對裸鼠成像1次。4周后，每組處死3只裸鼠，取出鼠腦后固定于福爾馬林，用于蘇木素伊紅（HE）染色和IHC實驗。每組剩余裸鼠飼養(yǎng)至實驗結(jié)束，用于動物生存分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 用x±s表示所有實驗數(shù)據(jù)。用Graphpad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。One-way ANOVA法用于分析多組數(shù)據(jù)是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Kaplan-Meier法檢驗各組生存率差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMZ聯(lián)合amlexanox顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖 U87 MG和原代GBM細(xì)胞經(jīng)不同濃度的單藥或聯(lián)合藥物處理24、48、72 h。CCK-8結(jié)果顯示，TMZ或amlexanox對腫瘤細(xì)胞增殖能力的抑制作用隨藥物濃度增加而增強（圖1）。與其他3組比較，TMZ+amlexanox組U87 MG和原代GBM細(xì)胞增殖能力明顯抑制（圖1）。而且，TMZ組和amlexanox組U87 MG 72 h藥物半抑制濃度（IC50）分別為200 μmol/L 和 600 μmol/L，二者聯(lián)合處理后 IC50分別降至 130 μmol/L（TMZ） 和 180 μmol/L。TMZ+amlexanox組原代GBM細(xì)胞72 h藥物IC50值也顯著降低。依據(jù)IC50值，本研究分別選擇TMZ:100μmol/L和 amlexanox：50 μmol/L 進行后續(xù)實驗。

2.2 TMZ聯(lián)合amlexanox能有效抑制Akt激活 Western印跡實驗結(jié)果顯示，無論是U87 MG細(xì)胞還是原代GBM細(xì)胞，不同處理方式均不能改變細(xì)胞中Akt和mTOR蛋白質(zhì)表達(dá)量，但TMZ組p-Akt表達(dá)量輕度升高，amlexanox組IKBKE表達(dá)量明顯降低。TMZ+amlexanox組U87 MG和原代GBM細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR表達(dá)水平顯著降低（圖2）。

2.3 TMZ聯(lián)合amlexanox能顯著抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力 劃痕實驗結(jié)果表明，TMZ+amlexanox組U87 MG和原代GBM細(xì)胞劃痕愈合面積顯著低于TMZ 組和 amlexanox組（P＜0.001，圖 3A、2B），Transwell遷移實驗結(jié)果也表明，TMZ+amlexanox組U87MG和原代GBM細(xì)胞24 h后穿出小室細(xì)胞數(shù)量顯著低于 TMZ 組和 amlexanox組（P＜0.05，圖 3C、D）。Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，TMZ+amlexanox組U87 MG和原代GBM細(xì)胞穿出數(shù)量顯著降低（P＜0.01，圖 3C、3D）。

2.4 TMZ聯(lián)合amlexanox抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長 動物實驗結(jié)果如圖4A、4B、4C所示，TMZ組裸鼠顱內(nèi)腫瘤體積略小于對照組，而TMZ+amlexanox組裸鼠顱內(nèi)腫瘤體積顯著小于TMZ組和對照組，且TMZ+amlexanox組裸鼠生存中位數(shù)也顯著高于TMZ組和對照組（31 d比25.5 d和21 d）。HE結(jié)果也提示，TMZ+amlexanox組裸鼠顱內(nèi)腫瘤體積顯著小于另外兩組（圖4D）。另外，與體外細(xì)胞實驗結(jié)果一致，IHC結(jié)果表明，TMZ+amelexanx組p-Akt和p-mTOR在顱內(nèi)腫瘤中表達(dá)水平明顯降低（圖4D）。

圖1 TMZ聯(lián)合amlexanox對U87 MG和原代GBM細(xì)胞增殖能力的影響Fig 1 Effect of TMZ combined with amlexanox on proliferation of U87 MG and primary GBM cells

圖2 TMZ聯(lián)合amlexanox對U87 MG和原代細(xì)胞中IKBKE、Akt、mTOR等蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of TMZ combinedwith amlexanox on the expression of IKBKE,Akt,mTOR and other proteins for U87 MG and primary GBM cells

圖3 TMZ聯(lián)合amlexanox對U87 MG細(xì)胞和原代細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig 3 Effect of TMZ combined with amlexanox on the migration and invasion of U87 MG and primary GBM cells

圖4 TMZ聯(lián)合amlexanox對裸鼠顱內(nèi)腫瘤的影響Fig 4 Effect of TMZ combined with amlexanox on orthotopic intracranial tumors of nude mice

3 討論

TMZ普遍用于膠質(zhì)瘤治療，誘導(dǎo)DNA加合物形成是TMZ產(chǎn)生細(xì)胞毒性最主要機制[14]。盡管TMZ能改善GBM患者預(yù)后，但易產(chǎn)生耐藥性[15]。臨床上迫切需要一種針對膠質(zhì)瘤患者更有效的治療措施。本研究利用一系列實驗證明TMZ聯(lián)合小分子抑制劑amlexanox，能有效抑制U87 MG細(xì)胞和原代GBM細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并能顯著抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長和延長裸鼠生存期。

耐藥性的產(chǎn)生是治療膠質(zhì)瘤患者失敗的最主要原因。Akt作為重要的細(xì)胞蛋白質(zhì)，其異常激活參與多種細(xì)胞活動，如細(xì)胞增殖、生存、糖代謝等。日益增多的研究證實，Akt激活與TMZ耐藥性相關(guān)，而且TMZ能誘導(dǎo)Akt異常激活更增加腫瘤細(xì)胞對TMZ耐藥性[16-17]。大量研究已經(jīng)證實，抑制Akt通路能降低腫瘤細(xì)胞對TMZ耐藥性，增強其細(xì)胞毒性作用[18-22]。其中Bi等[19]證實Cordycepin能通過激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMPK）和抑制Akt通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進凋亡。Wu等[20]證實FK228能通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt/mTOR通路促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長。本研究也表明，TMZ聯(lián)合amlexanox能顯著抑制p-Akt和p-mTOR表達(dá)水平，進而抑制細(xì)胞增殖能力。Amlexanox作為IKBKE的選擇性抑制劑，不僅能調(diào)節(jié)糖代謝[23]，還能通過抑制Hippo通路而發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。另外，IKBKE在乳腺癌和小細(xì)胞肺癌中參與Akt的異常激活[16,24]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)，amlexanox能增強TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性作用，可能與amlexanox抑制IKBKE活性而抑制p-Akt表達(dá)并逆轉(zhuǎn)TMZ誘導(dǎo)Akt激活有關(guān)。

綜上所述，本研究證實TMZ聯(lián)合amlexanox能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并能顯著抑制原代GBM細(xì)胞在裸鼠顱內(nèi)成瘤。Amlexanox能降低腫瘤細(xì)胞對TMZ耐藥性，增強TMZ細(xì)胞毒性作用，可能與amlexanox抑制IKBKE活性而部分逆轉(zhuǎn)TMZ誘導(dǎo)Akt激活有關(guān)。這為TMZ聯(lián)合小分子抑制劑治療膠質(zhì)瘤提供新的臨床治療思路。