徐朝陽, 張 顯, 徐美娟, 楊套偉, 饒志明*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無錫214122）

谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）能將谷氨酰胺分解為谷氨酸和游離的氨氣。 人體內(nèi)的谷氨酰胺酶主要分為腎型谷氨酰胺酶和肝型谷氨酰胺酶[1]，與細(xì)胞生長、代謝有關(guān)，可維持人體的酸堿平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。 谷氨酰胺酶還廣泛存在于曲霉、酵母、細(xì)菌等微生物中。 其中， 在微生物中， 研究較多的有Micrococcus luteusK-3[2-3]，Aspergillus oryzaeRIB40[4-5]，Bacillussp LKG-01[6]，Lactobacillus reuteriKCTC 3594[7]和Cryptococcus nodaensis[8]。 谷氨酰胺酶在日本醬油發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，不僅可以增加醬油的風(fēng)味，還可以增加醬油的營養(yǎng)成分。 但是，醬油釀造過程中的18%左右的高鹽環(huán)境限制了谷氨酰胺酶的應(yīng)用。 MaMoru wakayama 等人[2]研究表明，來源于Micrococcus luteusK-3 在8%～16%的鹽濃度下可以穩(wěn)定表達(dá)， 并且相對(duì)于無鹽條件下，酶活提高了1.3 倍。所以，我們合成編碼該谷氨酰胺酶的基因，將其在B. subtilis168 中表達(dá)。

枯草芽孢桿菌是一類非致病性細(xì)菌，被美國食品和藥物管理局評(píng)定為安全菌株（GRAS）[9]。 食品工業(yè)在全球商業(yè)應(yīng)用中，枯草芽孢桿菌被人類和動(dòng)物當(dāng)作益生菌使用[10]，同時(shí)，它還能治療胃腸道疾病[11]。 枯草芽孢桿菌是一個(gè)食品級(jí)表達(dá)宿主[12]，可用于異源表達(dá)蛋白質(zhì)和維生素[13]。

在微生物中，用質(zhì)粒過表達(dá)外源基因時(shí)，在復(fù)制的過程中常出現(xiàn)不穩(wěn)定的狀態(tài)（ssDNA）[14]，而導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失。 不添加抗生素條件下，會(huì)使這種現(xiàn)象很突出，從而限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。 在之前的一項(xiàng)研究中，單拷貝β 半乳糖苷酶基因被整合到枯草芽孢桿菌的基因組DNA 中[15-16]，重組菌株的酶活很低，我們可以通過提高外源基因的拷貝數(shù)來提高其表達(dá)量。 堿性蛋白酶E（aprE）和中性蛋白酶E（nprE）被認(rèn)為是主要的蛋白酶，因?yàn)樗鼈兊幕钚栽诳莶菅挎邨U菌分泌總蛋白酶活性的20%和70%[17-19]。 選用蛋白酶作為整合表達(dá)位點(diǎn)，既可以增加外源基因的拷貝數(shù)，又可以降低蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解。 本研究將來源于Micrococcus luteusK-3的谷氨酰胺酶基因（Mglu）[2]以lox序列重組的方式定點(diǎn)整合入B. subtilis168 中的nprE 和aprE 基因位點(diǎn)，進(jìn)而得到食品級(jí)表達(dá)谷氨酰胺酶的重組菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

菌株、質(zhì)粒、引物如表1 所示。

表1 菌株、質(zhì)粒、引物一覽表Table 1 Strains，plasmids and primers

續(xù)表1

1.2 培養(yǎng)基和試劑

LB 培 養(yǎng) 基（g/dL）：蛋 白 胨1，酵 母 膏 0.5，NaCl 1。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/dL）：葡萄糖2.5，安琪酵母4，NH4Cl 0.4，KH2PO40.1125，K2HPO4·3H2O 0.1875，CaCl20.2，L-谷氨酸鈉0.2；pH 7.0。

SPI 培養(yǎng)基（g/dL）：KH2PO40.6，K2HPO4·3H2O 1.83， （NH4）2SO40.2，Na3C6H5O7·2H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.02，葡萄糖0.5，酪蛋白水解物0.02，酵母提取物0.1，色氨酸0.005；115 ℃，滅菌25 min。

SPII 培養(yǎng)基：SPI 培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)98%，CaCl22.7 mg/L，MgCl20.48 mg/L；115 ℃，滅菌25 min。

100×EGTA：10 mmol/L EGTA 溶 液，NaOH 調(diào)pH 值至8.0。

質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白純化試劑盒、基因組提取試劑盒、PCR 試劑：購于中國大連市TaKaRa 公司。

1.3 重組B. subtilis 168 的構(gòu)建

1.3.1 B. subtilis 168 基因組的提取B. subtilis 168 基因組的提取按照基因組提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.3.2 整合片段同源臂的擴(kuò)增通過NCBI 查詢可得到B. subtilis 168 aprE、nprE 基因的序列，選擇兩側(cè)大約600～700 bp 的片段作為同源臂，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增同源臂。 同源臂PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體系中，模板為B. subtilis 168 基因組，aprE 基因上下游同源臂引物對(duì)分別是P1、P2 和P7、P8，nprE 基因上下游同源臂引物為P9、P10 和P15、P16。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測(cè)定核酸濃度。

1.3.3 lox71-zeo-lox66 基因片段的擴(kuò)增通過NCBI 網(wǎng)站查詢到p7Z6 質(zhì)粒全基因序列，根據(jù)其中l(wèi)ox71-zeo-lox66 的基因序列， 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增lox71-zeo-lox66。 PCR 體系中，模板為p7Z6，aprE 基因位點(diǎn)lox71-zeo-lox66 基因的引物為P3 和P4，nprE 基因位點(diǎn)lox71-zeo-lox66 基因的引物為P11 和P12。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測(cè)定核酸濃度。

1.3.4 HpaII-Mglu 基因片段的擴(kuò)增根據(jù)HpaII和Mglu 基因的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)擴(kuò)增HpaII-Mglu 基因，PCR 體系中，模板為pMA5-HpaII-Mglu，aprE 基因插入位點(diǎn)HpaII-Mglu 基因的擴(kuò)增引物為P5 和P6，nprE 基因插入位點(diǎn)HpaII-Mglu 基因的擴(kuò)增引物為P13 和P14。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測(cè)定核酸濃度。

1.3.5 上下游同源臂、lox71-zeo-lox66 基因、HpaIIMglu 基因的融合4個(gè)基因片段的融合，參照兩步法融合方法[21]，操作具體如下：

第1 步PCR 體系如表2 所示：

PCR 條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃解鏈8 s，61 ℃退火5 s，72 ℃延伸4 min，共13個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫20 min。

表2 4 片段融合第1 步PCR 體系Table 2 First step PCR fusion consists of four segments

第2 步PCR 體系如表3 所示：

PCR 條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃解鏈10 s，61 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min， 共28個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫20 min。

表3 4 片段融合第2 步PCR 體系Table 3 Second step PCR confusion consists of four segments

1.3.6 B. subtilis 168 感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化將-40 ℃甘油管保存的B. subtilis168 在LB 固體瓊脂平板上劃線活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h， 取單菌落接種于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)接200 μL 菌液于SPI 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)5 h， 轉(zhuǎn)接1 mL 菌液于SPII 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)1.5 h。 接著，于SPII 培養(yǎng)基中加入110 μL 100×EGTA，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)10 min。 所得菌液即為B. subtilis168 感受態(tài)細(xì)胞，將菌液分裝，500 μL 每管。轉(zhuǎn)化時(shí)加入重組DNA 片段， 輕輕振蕩混勻。 37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)90 min，涂布含有博萊霉素（25 mg/L）的LB 固體瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h[22]。

1.3.7 抗性基因的敲除pTSC 質(zhì)粒表達(dá)CRE 酶，會(huì)引導(dǎo)lox序列重組，消除抗性基因。 將上述方法得到的B. subtilis168 轉(zhuǎn)化子，再次制作成感受態(tài)。 將pTSC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有卡那霉素（100 mg/L）的固體LB 平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 將得到含有陽性轉(zhuǎn)化子在51 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使溫度敏感型質(zhì)粒pTSC 丟失。

1.3.8 重組B. subtilis 168 的構(gòu)建按照上述方法制作B. subtilis168 感受態(tài)之后， 將得到的aprE、nprE 位點(diǎn)的融合片段分別轉(zhuǎn)化到B. subtilis168 感受態(tài)中，篩選到陽性轉(zhuǎn)化子，按照上述方法將抗性基因敲除后得到重組菌株BSM1 和BSM2。 接著，在BSM1 的基礎(chǔ)上， 將nprE 位點(diǎn)的融合片段轉(zhuǎn)化到BSM1 的感受態(tài)中，篩選到陽性轉(zhuǎn)化子，敲除抗性基因，得到BSM3。

1.4 重組B. subtilis 168 的發(fā)酵

將重組菌株分別在LB 平板上劃線， 挑選單菌落接種于10 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h。將1 mL 菌液轉(zhuǎn)接入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL 錐形瓶），于24 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。 收集得到的菌體用于酶活測(cè)定和SDS-PAGE 分析。

1.5 重組谷氨酰胺酶的蛋白純化及SDS-PAGE 分析

1.5.1 粗酶液的制取將發(fā)酵得到的菌體，10000 r/min 離心5 min 后收集菌體，用50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液洗滌2次后，用破碎緩沖液懸浮菌體。 加入溶菌酶 （終質(zhì)量濃度為1 mg/mL），混勻，在4 ℃條件下放置2 h。 將離心管置于冰中，超聲破碎細(xì)胞，條件為：功率400 W，工作1 s 停2 s，總時(shí)間為5 min。 將破碎后的菌液，在4 ℃條件下，10000 r/min 離心20 min，獲得上清液。 將上清液用0.45 μm 濾膜過濾，即可得到粗酶液。

1.5.2 蛋白質(zhì)純化將粗酶液用Ni-NTA 蛋白純化柱進(jìn)行純化。 純化操作按照AKTA 蛋白純化儀說明書進(jìn)行。上樣體積為5 mL，洗脫流量為0.5 mL/min。

1.5.3 谷氨酰胺酶的SDS-PAGE 分析分別吸取80 μL BSM3 重組菌株的純酶液、 粗酶液和B.subtilis168 的粗酶液，加入20 μL 5×Loading Buffer，混勻后煮沸20 min，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。 分離膠濃縮膠體積分?jǐn)?shù)分別為12%和4%。 上樣量為15 μL。

1.6 酶活測(cè)定

本研究使用的是通過測(cè)定產(chǎn)物谷氨酸的含量[23]，進(jìn)而測(cè)定谷氨酰胺酶酶活的方法。 具體如下：

酶活測(cè)定體系（1 mL）為：850 μL 用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）溶解50 mmol/L 谷氨酰胺的底物溶液，37 ℃水浴鍋預(yù)熱5 min， 加入20 μL 粗酶液，對(duì)照加入100 μL 15 g/dL 的三氯乙酸，混勻后在37 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)5 min， 迅速加入100 μL 15 g/dL的三氯乙酸并混勻， 對(duì)照加入20 μL 粗酶液并混勻，反應(yīng)終止。 將反應(yīng)液10000 r/min 離心10 min，以去除蛋白質(zhì)，接著，取25 μL 反應(yīng)液測(cè)定谷氨酸含量。 酶活定義：在37 ℃條件下，1 min 內(nèi)反應(yīng)生成1 μmol 的谷氨酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.7 重組菌株的穩(wěn)定性分析

單細(xì)胞微生物的生長繁殖，細(xì)胞呈現(xiàn)幾何級(jí)數(shù)2n增長，當(dāng)n＝7 時(shí)，27＝128，將靜止期的菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種，再將其培養(yǎng)至靜止期，即可認(rèn)為細(xì)胞已連續(xù)傳代7次[24-25]。 分別將BSM、BSM3 重組菌株在LB 瓊脂平板上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 接著，分別挑選BSM、BSM3 重組菌株單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，作為種子液。分別將1 mL 菌液轉(zhuǎn)接至100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（500 mL 錐形瓶），24 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h 后，分別取樣測(cè)酶活，同時(shí)繼續(xù)將1 mL 菌液轉(zhuǎn)接至100 mL 新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基（500 mL錐形瓶）。 依此類推，每隔24 h 取樣測(cè)定酶活，共測(cè)定6次。

1.8 重組菌BSM35 L 發(fā)酵罐發(fā)酵水平分析

將重組菌株BSM3 在LB 固體平板劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種至10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h。 吸取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接于100 mL LB 培養(yǎng)基中 （1000 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)10 h，作為種子液。 接著將種子液全部轉(zhuǎn)接進(jìn)5 L 發(fā)酵罐中（2 L發(fā)酵培養(yǎng)基），控制條件：溫度為24 ℃，pH 為7.0（體積分?jǐn)?shù)50%磷酸和50%氨水控制）、轉(zhuǎn)速為450 r/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株構(gòu)建

重組菌株構(gòu)建過程，見圖1，我們根據(jù)上述方法擴(kuò)增出了各個(gè)片段（見圖2），并構(gòu)建了2個(gè)蛋白酶基因位點(diǎn)的融合片段 （見圖3）， 并成功轉(zhuǎn)化入B.subtilis168 感受態(tài)中，通過博萊霉素抗生素平板篩選到陽性轉(zhuǎn)化子，接著用pTSC 質(zhì)粒去除抗性基因，成功得到無抗性基因的重組菌株BSM1 和BSM2。在重組菌株BSM1 的基礎(chǔ)上，在nprE 基因位點(diǎn)插入Mglu基因，去除抗性基因后，得到重組菌株BSM3。通過增加谷氨酰胺酶基因Mglu的整合表達(dá)位點(diǎn)，可能能解決單拷貝基因表達(dá)產(chǎn)物低的問題。

圖1 Mglu 基因整合入B. subtilis 168 染色體DNA 過程示意圖Fig. 1 Strategy for integrating Mglu gene in B. subtilis 168 chromosome DNA

一個(gè)融合片段包括兩段同源臂、HpaII-Mglu基因和lox71-zeo-lox66 基因。 由于同源區(qū)域的存在，B. subtilis168 染色體DNA 會(huì)在敲除基因（aprE 或nprE）的同時(shí)，引入HpaII-Mglu基因和lox71-zeolox66 基因。 接著，會(huì)通過CRE/loxp系統(tǒng)敲除lox71序列和lox66 序列之間的zeo抗性基因， 并形成了lox72 序列。

圖2 lox71-zeo-lox66、HpaII-Mglu 和上下游同源臂片段的PCR 電泳圖Fig. 2 PCR electrophoresis of lox71-zeo-lox66，HpaIIMglu and two homologous arm segments

圖3 融合片段PCR 電泳圖Fig. 3 PCR electrophoresis of fusion segaments

2.2 重組菌株的發(fā)酵酶活對(duì)比

為了探究不同重組菌株的谷氨酰胺酶表達(dá)水平， 按照上述方法對(duì)菌株B. subtilis 168、BSM1、BSM2、BSM3 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。 如圖4 所示，重組菌株的生長趨勢(shì)和野生型菌株B. subtilis 168 趨勢(shì)基本保持一致， 在18 h 時(shí)達(dá)到最大菌濃，OD600為9 左右。 重組菌株的最大發(fā)酵酶活如圖5 所示，野生型菌株B. subtilis 168 無谷氨酰胺酶酶活， 重組菌株BSM1、BSM2 和BSM3 的最大發(fā)酵酶活分別為0.5、0.6 U/mL 和1.0 U/mL。 重組菌株BSM1 和BSM2 中Mglu 基因的拷貝數(shù)都是1， 但BSM2 相對(duì)于BSM1的谷氨酰胺酶酶活要高，原因可能是中性蛋白酶對(duì)表達(dá)的谷氨酰胺酶降解量更多，將其敲除之后更有利于谷氨酰胺酶的表達(dá)。很顯然，重組菌株BSM3 的發(fā)酵酶活最高， 重組菌株BSM3 相對(duì)于BSM1 酶活提高了100%（圖5）。使用整合表達(dá)外源基因可以避免游離質(zhì)粒表達(dá)分離不穩(wěn)定的問題，但是目的基因表達(dá)量低成為整合表達(dá)的一大障礙。 我們可以通過增加整合表達(dá)位點(diǎn)和敲除內(nèi)源性蛋白酶的方法增加目的蛋白基因的表達(dá)量。

圖4 重組菌株生長曲線Fig. 4 Growth curve of recombinant strains

2.3 重組谷氨酰胺酶的蛋白質(zhì)純化

圖5 重組菌株和B. subtilis 168 最大發(fā)酵酶活對(duì)比分析Fig. 5 Maximum fermentation glutaminase activities of the recombinant strains and B. subtilis 168

在重組菌株構(gòu)建過程中，Mglu 基因前面3’端添加了His-tag 序列，所以可以通過Ni2+親和層析分離出谷氨酰胺酶。 純化后的谷氨酰胺酶的SDSPAGE 電泳圖如圖6 所示，以B. subtilis 168 作為陰性對(duì)照， 粗酶液和純酶液在大約4.8×104位置有一條明顯的條帶。 酶活測(cè)定可知，BSM3 表達(dá)的谷氨酰胺酶比酶活為1326 U/mg，大小基本與報(bào)道一致[2]。

圖6 重組菌株BSM3 表達(dá)谷氨酰胺酶SDS-PAGE 電泳圖Fig. 6 SDS -PAGE analysis of the expression of glutaminase in BSM3

2.4 重組菌株BSM3 的遺傳穩(wěn)定性分析

整合型菌株的遺傳穩(wěn)定性是衡量工業(yè)生產(chǎn)菌株的一個(gè)重要因素。 相對(duì)于游離質(zhì)粒表達(dá)，整合表達(dá)可以提高外源基因的遺傳穩(wěn)定性。 在無抗生素條件下， 我們通過連續(xù)轉(zhuǎn)接重組菌株并測(cè)定酶活，分析重組菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7 所示，重組菌株BSM3 在連續(xù)傳代42次之后， 酶活依然穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性較好。 然而，游離質(zhì)粒表達(dá)Mglu 基因重組菌株BSM 在連續(xù)傳代14次之后，酶活明顯下降，遺傳穩(wěn)定性很差。 微生物使用游離質(zhì)粒過表達(dá)谷氨酰胺酶的優(yōu)勢(shì)很明顯，可以大大地提高酶活。 但是，質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性很差，被認(rèn)為是其表達(dá)的一大問題，限制了在工業(yè)中的應(yīng)用。 所以，整合型表達(dá)谷氨酰胺酶菌株BSM3 更適合工業(yè)生產(chǎn)。

圖7 重組菌株BSM3、BSM 遺傳穩(wěn)定性分析Fig. 7 Analysis of genetic stability of the recombinant strains BSM3 and BSM

2.5 5 L 發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵

由于搖瓶發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)有限，限制了重組菌株BSM3 的生物量，為了提高谷氨酰胺酶的產(chǎn)量，我們選擇使用5 L 發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。 結(jié)果如圖8 所示，重組菌株BSM3 在7 h 左右時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。在32 h 左右時(shí)，OD600達(dá)到了最大，約為92。 我們發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酶曲線和生長曲線存在一定的相關(guān)性。 酶活在32 h 左右是達(dá)到了最大，為41.5 U/mL。 32 h 之后，谷氨酰胺酶酶活有逐漸降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵摴劝滨０访覆环€(wěn)定，發(fā)生了變性，導(dǎo)致酶活降低。

圖8 重組菌株BSM35 L 發(fā)酵罐發(fā)酵水平分析Fig. 8 Fed-batch fermentation of the recombinant strain BSM3

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建穩(wěn)定的重組谷氨酰胺酶表達(dá)菌株，選擇對(duì)B. subtilis 168 進(jìn)行定點(diǎn)整合，來表達(dá)谷氨酰胺酶，提高M(jìn)glu 基因的遺傳穩(wěn)定性。 增加基因表達(dá)產(chǎn)物活性可以通過在基因上游插入強(qiáng)啟動(dòng)子、增加結(jié)構(gòu)基因拷貝數(shù)、對(duì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造、降低降解或抑制表達(dá)產(chǎn)物活性物質(zhì)的表達(dá)等方式進(jìn)行。 本實(shí)驗(yàn)中在使用強(qiáng)啟動(dòng)子HpaII 的基礎(chǔ)上， 在敲除2個(gè)內(nèi)源性蛋白酶基因aprE、nprE 的同時(shí)， 插入谷氨酰胺酶基因。 既增加了谷氨酰胺酶的拷貝數(shù)，又降低了蛋白酶對(duì)表達(dá)產(chǎn)物谷氨酰胺酶的降解。 通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，增加谷氨酰胺酶基因拷貝數(shù)，可有效提高谷氨酰胺酶表達(dá)水平。 本實(shí)驗(yàn)中采用lox 序列重組的方式將Mglu 基因整合到B. subtilis 168 染色體上，抗性基因也插入到了染色體上， 表達(dá)pTSC 質(zhì)粒上重組酶CRE，引導(dǎo)lox 序列重組，消除抗性基因，因此， 該重組表達(dá)谷氨酰胺酶菌株BSM3 可直接用于食品發(fā)酵。