趙利利， 薛林林， 李彬彬， 蔣艾廷， 盧士玲

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832003）

熏馬腸是新疆哈薩克民族特色的傳統(tǒng)肉類制品，深受大眾喜愛。 據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，新疆伊犁地區(qū)哈薩克族群眾食管癌的發(fā)病率是全國平均水平的2.3 倍， 其中熏馬腸中生物胺含量過高可能是引起食管癌的一個(gè)重要原因[1]。 組胺是毒性較強(qiáng)的一種生物胺，正常條件下，食品中外源性攝入的組胺在組胺氧化酶的作用下會(huì)被迅速降解，但每當(dāng)降解過程受到干擾，或者組胺量過高，食物中存在的組胺可導(dǎo)致組胺中毒或不耐受的情況[2]。 中毒癥狀通常表現(xiàn)為頭痛、心跳呼吸加快、血壓下降等[3]。 組胺是游離組氨酸在微生物的組氨酸脫羧酶作用下，發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的[4]。 許多因素可能會(huì)影響熏馬腸中組胺的產(chǎn)生，如食品的理化特性（即pH 值和AW）、原料質(zhì)量、生產(chǎn)過程、產(chǎn)組胺微生物的存在以及游離組氨酸的可用性[2]。 在香腸的生產(chǎn)、貯藏和銷售過程中均會(huì)有組胺的積累[5-6]。

目前許多研究指出，天然植物提取物對(duì)組胺具有較好的抑制效果[7]。 在肉制品中，多酚類化合物已被證明對(duì)組胺的形成有很好的抑制作用[6，8]。 阿魏酸是酚類化合物的一種，存在于水果、糧食、蔬菜、中藥中，其中，谷物麩皮中含量最高[9-10]，據(jù)報(bào)道，它具有多種生理功能，對(duì)多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)性疾病都有廣泛的治療作用[11]。 隨著世界范圍內(nèi)非傳染性慢性疾病患病率的增加，既能夠改善食品品質(zhì)，又具有特殊功能的天然食品添加劑將具有更加廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景[12]。 阿魏酸在日本被正式批準(zhǔn)為食品添加劑， 可以加入餅干、熟食，主要用作食品抗氧化劑提高食品質(zhì)量。 魏延玲在阿魏酸對(duì)風(fēng)干鱸魚中N-亞硝胺及生物胺的抑制作用的研究中發(fā)現(xiàn)阿魏酸對(duì)組胺有很好的抑制作用，使用阿魏酸能顯著抑制風(fēng)干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的生長(zhǎng)（P＜0.05）[13]。 而關(guān)于阿魏酸能否抑制熏馬腸中組胺和產(chǎn)組胺微生物的研究還未見報(bào)道。 此外， 傳統(tǒng)的變性梯度凝膠電泳 （PCRDGGE） 方法通常用于檢測(cè)整個(gè)體系中微生物的動(dòng)態(tài)變化， 而不能區(qū)分產(chǎn)組胺和不產(chǎn)組胺的微生物。本研究用帶GC 夾的產(chǎn)組胺微生物特異性引物結(jié)合PCR-DGGE 檢測(cè)方法，監(jiān)測(cè)阿魏酸對(duì)熏馬腸發(fā)酵過程中產(chǎn)組胺微生物的影響作用，為一些復(fù)雜的發(fā)酵食品（如奶酪）中產(chǎn)組胺微生物的鑒定提供一種快速簡(jiǎn)便的方法。

作者以新鮮馬肉為原料，參考張雅晴[14]熏馬腸加工工藝，并通過添加不同質(zhì)量濃度阿魏酸，探討阿魏酸添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)、游離組氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微生物數(shù)、產(chǎn)組胺微生物等方面的影響，旨在利用阿魏酸對(duì)熏馬腸中組胺的作用效果進(jìn)行研究，為將阿魏酸應(yīng)用于熏馬腸及其他發(fā)酵香腸提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑阿魏酸 （純度98%）、 組氨酸（純度99%）：北京博奧拓科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；組胺（純度97%）、丹磺酰氯（純度99%）：美國Sigma 公司產(chǎn)品；MRS、MSA、VRBGA 和假單胞菌屬選擇性培養(yǎng)基： 北京奧博星生物試劑公司產(chǎn)品；三乙胺：石家莊世紀(jì)隆鑫商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；異硫氰酸苯酯（純度99%）：上海澤崇醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；馬肉：購自伊犁牧民家庭；動(dòng)物腸衣、煙熏液：市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備LDZX-40 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠制造；LC-2010AHT 高效液相色譜儀： 日本島津公司產(chǎn)品； 色譜柱（Ecilpse XDB-C184.6 mm×250 mm，5 μm）： 上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)品；ZXRD-7080 全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；ZHWY-1111 落地普通型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；DNP-9272 恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏有限公司產(chǎn)品；KQ-250B 型超聲波清洗器： 江蘇同君儀器科技有限公司產(chǎn)品；EPED-20TJ實(shí)驗(yàn)室超純水器：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；UB-7pH 計(jì)： 美國賽多利斯丹佛公司產(chǎn)品；PCR 儀: 美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品；DGGE 儀： 美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品；水平電泳儀：北京市六一儀器廠制造；凝膠成像儀：美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 新疆熏馬腸的制作工藝

1） 工藝配方 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 瘦肉80%， 肥肉20%，白糖2%，食鹽2.5%，姜粉0.2%，胡椒粉0.1%，八角0.1%，花椒粉0.15%，味精0.1%，五香粉0.1%，亞硝酸鈉0.01%，煙熏液1%。

2） 加工工藝 原料肉處理 （紫外燈照射30 min）→修整、切?。ㄇ行∧粗干现讣獯笮。淞稀缰?（4 ℃，1 d）→接種→灌腸→發(fā)酵 （18 ℃，RH90%～95%，2 d）→成熟（12 ℃，RH70%～75%，25 d）→成品。 分別在第0、3、7、14、28 天取樣，對(duì)微生物數(shù)量、水分含量、pH 測(cè)定，置于-20 ℃冷凍保藏，以備組胺和組氨酸的測(cè)定。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)將腌制好的原料肉均勻地分為4組， 分別做如下處理： 第I 組添加0 mg/kg 的阿魏酸；第II 組添加100 mg/kg 的阿魏酸；第III 組添加300 mg/kg 的阿魏酸；第Ⅳ組添加500 mg/kg 的阿魏酸。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)取20 g 香腸， 加入到180 mL無菌生理鹽水中，在200 r/min 室溫下?lián)u1 h。 混合液稀釋后于對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基進(jìn)行均勻涂布。 乳酸菌用MRS 培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)72 h；葡萄球菌/微球菌用MSA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h； 腸細(xì)菌用VRBGA 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h。 假單胞菌屬用假單胞菌屬選擇性培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.4 樣品pH 值測(cè)定無菌條件下稱取樣品20 g于180 mL 滅菌生理鹽水中，在200 r/min 室溫下?lián)u1 h，用pH 計(jì)進(jìn)行上部清液pH 值測(cè)定。

1.2.5 水分含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取樣品2 g 于平板中，于105 ℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，取出置于干燥皿中冷卻，計(jì)算出水分含量。

1.2.6 細(xì)菌DNA 組的提取無菌條件下取樣品20 g 于180 mL 滅菌生理鹽水， 使用物料拍打機(jī)拍打20 min， 取上清液5 mL 在4 ℃條件下2500 r/min離心5 min，去沉淀，取上清液于干凈離心管中4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min，棄去上清液，用滅菌的移液槍將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，然后根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒操作步驟提取總DNA，提取的DNA 中加入150 μLTE 緩沖液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 PCR-DGGE

1）PCR 對(duì)所分離菌的16S rDNA 的V6-V8 區(qū)段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 選用引物對(duì)為： 上游引物：ChdcDG-F （5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGGGCACGGGGGCCTGGTCAAGGCTATGGTG TATGGTC -3′ ） 下 游 引 物：hdcDG -R （5′ -GGTTTCATCATTGCGTGTGCAAA-3′）[15]。

PCR 反應(yīng)為25 μL 體系：1 μL 模板DNA，上游引 物 和 下 游 引 物 各1.5 μL，2 × Taq PCR Master Mix12 μL，ddH2O 9 μL。

擴(kuò) 增 程 序：94 ℃預(yù) 變 性5 min，35個(gè) 循 環(huán)（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；68 ℃，30 s）， 最終68 ℃延伸10 min。用1.5 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物后，進(jìn)行DGGE 分析。

2）變性梯度凝膠電泳（DGGE） 聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度為8 g/dL （丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5 g∶l g）。 變性梯度從35%～55%，制好膠后點(diǎn)樣，在0.5×TAE 緩沖液中， 先200 V 電壓預(yù)跑15 min，然后在80 V 恒壓下電泳14 h。 將DGGE 膠片在含0.5 μL/mL EB 的超純水中搖床染色20 min。再用超純水20 min 脫色3次后，用凝膠成像儀拍照。 在紫外燈照射下用滅菌的刀片切割所需的明亮條帶，放入無菌的1.5 mL 離心管中， 加入20 μL TE 溶液淹沒切割下的條帶，4 ℃冰箱過夜后， 再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增 （上游引物為U968：5′-AACGCGAAGAACCT TAC-3′； 下游引物為L(zhǎng)1401：5′-CGGTGTGTACAA GACCC-3′），反應(yīng)體系同1.2.7.1，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，35個(gè)循環(huán)（95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72℃，30 s），最終72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物送去華大測(cè)序。 將測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。

1.2.8 HPLC 測(cè)定熏馬腸中組胺和游離組氨酸的含量

1） 組胺含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取組胺50 mg，用0.4 mol/L 的高氯酸溶液定容到50 mL 容量瓶中，稀釋至最終質(zhì)量濃度為：10、50、100、150、200 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液。 參考張雅晴[14]的方法來測(cè)定熏馬腸中的組胺。

2）游離組氨酸含量的測(cè)定[16]精密稱取組氨酸對(duì)照品20 mg，用0.1 mol/L 的鹽酸定容至10 mL 容量瓶中， 稀釋成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL 的組氨酸標(biāo)準(zhǔn)液， 加入500 μL 0.1 moL/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液（移取異硫氰酸苯酯1.2 mL用乙腈容至100 mL 容量瓶中） 和500 μL 1 moL/L三乙胺-乙腈溶液（移取三乙胺13.5 mL 用乙腈定容至100 mL 容量瓶中），搖勻靜置1 h，加入2 mL 正乙烷萃取，吸取下層溶液過膜，上機(jī)分析。

取2 g 熏馬腸樣品加入，30 mL 的0.1 mol/L 的鹽酸，超聲提?。?0 kHz）45 min，放冷離心，收集上清液待用。 取上述處理液1 mL，此后衍生處理方法同上。色譜柱為Agilent C18（4.6 mm×250 mm），流量1 mL/min，流動(dòng)相A：醋酸鈉7.5 g，加超純水850 mL溶解，用乙酸調(diào)pH 6.5，加水至925 mL 加乙腈70 mL，搖勻。 流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水。 用0.22 μm 濾膜過濾超聲30 min 后備用，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫31 ℃，梯度洗脫：0～18 min，A（100%～91%）；18.01～50 min，A（80%～67%）；50.01～60 min，A（0%）。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 統(tǒng)計(jì)，Origin 8.5 繪圖，SPSS 22 進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的分析

2.1.1 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由表1 可知，熏馬腸發(fā)酵過程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵成熟過程中由于較高的發(fā)酵溫度及較低的相對(duì)濕度使得水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降顯著（P＜0.05），到發(fā)酵成熟結(jié)束時(shí)對(duì)照組樣品中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.73%，相比發(fā)酵初期0 d（75.13%）下降了49.78%。 不同添加量的阿魏酸處理組與對(duì)照組相比水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的差異不顯著（P＞0.05），說明阿魏酸對(duì)熏馬腸的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)無影響。 這與楊蓉蓉等[17]在八角茴香提取物對(duì)風(fēng)干鱸魚加工貯藏過程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為相似。

2.1.2 pH 值由表1 可知，熏馬腸發(fā)酵過程中pH值呈先下降后上升的趨勢(shì)。 添加阿魏酸組熏馬腸中的pH 值要低于未添加阿魏酸組（P＞0.05），主要是由于阿魏酸本身的酸性，在熏馬腸的整個(gè)發(fā)酵成熟過程中pH 始終保持在酸性范圍（＜5.32）。 4 組熏馬腸在發(fā)酵初期（0～7 d），pH 值迅速下降，主要是由于加工過程中碳水化合物水解作用產(chǎn)生的乳酸、磷酸等其他有機(jī)酸的積累，酶促水解作用產(chǎn)生的游離氨基酸的累積[18]，使pH 值顯著下降（P＜0.05）。 發(fā)酵后期（14～28 d），pH 值開始回升，主要原因是在成熟過程中，微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生大量的含氮化合物等堿性緩沖物質(zhì)如組胺的積累，以及蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物的釋放。 在發(fā)酵結(jié)束后， 各組樣品的pH 值都處于5.14～5.26 之間，這與Lu 等[19]在研究熏馬腸發(fā)酵過程中pH 值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 而pH 值為5 左右的酸性條件有利于維持發(fā)酵香腸貨架期的穩(wěn)定性，各組終產(chǎn)品中的結(jié)果都符合香腸的這個(gè)要求。

2.2 微生物分布的分析

2.2.1 乳酸菌分析由表1 可知，隨著熏馬腸發(fā)酵過程的進(jìn)行，各組乳酸菌數(shù)量均先上升后下降的趨勢(shì)。 添加阿魏酸后各組的乳酸菌數(shù)量與對(duì)照組相比較低（P＞0.05）。 4個(gè)不同處理組的樣品中乳酸菌數(shù)量（lg（CFU/g））在第7 天時(shí)達(dá)到最大值8.15～8.29，可能與發(fā)酵后期較高的pH 值有關(guān)。 發(fā)酵結(jié)束 （第28 天）時(shí)，對(duì)照組乳酸菌總數(shù)（lg（CFU/g））為7.61±0.03，添加阿魏酸500 mg/kg 組乳酸菌總數(shù)（lg（CFU/g））為7.43±0.04，相對(duì)于對(duì)照組降低了2.37%。 楊蓉蓉等[17]研究了0、50、100、150、200 mg/kg 的八角茴香提取物對(duì)風(fēng)干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示，風(fēng)干結(jié)束時(shí)，添加500 mg/kg 八角茴香提取物處理組樣品中乳酸菌總數(shù)相對(duì)于對(duì)照組降低了6.88%，相對(duì)于八角茴香提取物，阿魏酸對(duì)乳酸菌的抑菌作用要弱。 乳酸菌是熏馬腸中的優(yōu)勢(shì)菌，主要是由于原料肉中乳酸菌數(shù)量較多以及它們?cè)诎l(fā)酵過程中較快的繁殖速度。 發(fā)酵后期4 組樣品中乳酸菌數(shù)量（lg（CFU/g））在7.43～7.61 范圍之間。 與國際上建議的乳酸菌在食品中的數(shù)量（lg（CFU/g））范圍6～8 相符[20]，說明產(chǎn)品安全性較高。

2.2.2 微球菌/葡萄球菌分析4 組熏馬腸中微球菌/葡萄球菌數(shù)量與乳酸菌數(shù)量的變化趨勢(shì)一致（表1），都是先上升后下降。發(fā)酵28 d 時(shí)，各組樣品中的微球菌/葡萄球菌數(shù)量（lg（CFU/g））在6.34～6.93 之間，與一些學(xué)者報(bào)道的熏馬腸中微球菌數(shù)量相近[17]。使用阿魏酸能顯著抑制熏馬腸終產(chǎn)品中微球菌/葡萄球菌的生長(zhǎng)（P＜0.05），發(fā)酵后期3 組添加阿魏酸組的熏馬腸中微球菌/葡萄球菌數(shù)量相對(duì)于空白對(duì)照組分別降低了3.17%、5.92%、8.51%。 呂珍等在阿魏酸對(duì)酒類酒球菌生長(zhǎng)作用機(jī)理的研究中也發(fā)現(xiàn)：50 mg/L 阿魏酸能夠強(qiáng)烈抑制酒類酒球菌的生長(zhǎng)，并且隨阿魏酸含量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)[21]。 何粉霞在阿魏酸和阿魏酸葡萄糖酯的生物活性研究中也發(fā)現(xiàn)阿魏酸對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌均有一定的抑制效果[22]。

表1 阿魏酸對(duì)新疆熏馬腸成熟過程中微生物和理化指標(biāo)的影響Table 1 Microbial counts （lg（CFU/g）） and physicochemical parameters during ripening of smoked horsemeat sausage after adding different concentrations of ferulic acid

2.2.3 腸細(xì)菌和假單胞菌屬分析由表1 可知，在發(fā)酵初期（0 d），腸細(xì)菌和假單胞菌屬的數(shù)量（lg（CFU/g））分別在3.20 和2.01 左右，與Lu 等[19]在熏馬腸中的研究結(jié)果相似。 在整個(gè)發(fā)酵過程中，各組腸細(xì)菌數(shù)量均呈下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。 添加阿魏酸后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組腸細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組中腸細(xì)菌數(shù)量（P＜0.05）。 成熟第28 天時(shí)， 添加阿魏酸300 mg/kg 和500 mg/kg 組熏馬腸樣品中均未檢測(cè)到腸細(xì)菌，另外在添加阿魏酸后，各組在發(fā)酵成熟期也都沒有檢測(cè)到假單胞菌屬。 Lu 等[19]在發(fā)酵劑和植物提取物對(duì)熏馬腸中生物胺的研究中指出，添加植物提取物后，在發(fā)酵后期均沒有檢測(cè)到腸細(xì)菌和假單胞菌屬。 說明阿魏酸和植物提取物對(duì)腸細(xì)菌和假單胞菌屬的生長(zhǎng)都具有顯著的抑制效果（P＜0.05）。王永麗等[23]在辣素對(duì)培根風(fēng)干成熟過程中微生物的抑制效應(yīng)中發(fā)現(xiàn)， 添加500 mg/kg 姜辣素處理組的腸細(xì)菌數(shù)量相對(duì)于空白對(duì)照組降低了19.44%，這說明阿魏酸對(duì)腸細(xì)菌的抑菌作用比姜辣素強(qiáng)。 腸細(xì)菌和假單胞菌屬是一類在發(fā)酵香腸中不受歡迎的菌種，很可能導(dǎo)致致病性危害以及對(duì)發(fā)酵香腸的感官品質(zhì)造成影響，尤其是一些大腸桿菌可以產(chǎn)生大量組胺。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿魏酸能有效地抑制腸細(xì)菌和假單胞菌屬的生長(zhǎng)，從而抑制組胺在熏馬腸發(fā)酵成熟過程中的積累。

2.3 DGGE 的分析

如圖1 DGGE 電泳圖所示，熏馬腸發(fā)酵過程中主要的產(chǎn)組胺微生物是Lactobacillus sakei，Enterobacter cloacae和Bacillus cereus（見 表2）。Maria Diaz 等[15]在使用PCR-DGGE 方法鑒定奶酪中產(chǎn)組胺菌的研究中得到Lactobacillus sakei是奶酪中的產(chǎn)組胺菌。Enterobacter cloacae和Bacillus cereus在很多文獻(xiàn)里也曾被報(bào)道是潛在的產(chǎn)組胺微生物[24-25]。 發(fā)酵前期，添加阿魏酸組與未添加阿魏酸組中存在的產(chǎn)組胺微生物相似。 在熏馬腸成熟的第7 天時(shí)， 添加阿魏酸500 mg/kg 組熏馬腸樣品中沒有檢測(cè)到這些產(chǎn)組胺微生物，成熟第28 天時(shí)，添加阿魏酸300 mg/kg 和500 mg/kg 組熏馬腸樣品中均未檢測(cè)到這些產(chǎn)組胺微生物，這與微生物的統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本一致。 說明阿魏酸對(duì)這些產(chǎn)組胺微生物有很好的抑制作用。

圖1 阿魏酸對(duì)新疆熏馬腸成熟過程中產(chǎn)組胺菌的PCRDGGE 圖譜Fig. 1 DGGE fingerprinting of PCR products of Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening by addition of ferulic acid at different concentrations

2.4 熏馬腸中的游離組氨酸和組胺的分析

表2 熏馬腸成熟過程中產(chǎn)組胺菌PCR-DGGE 圖譜上條帶序列分析Table 2 DNA sequencing results of histamine-producing bacterias found in smoked horsemeat sausage samples based on the cut bands from the DGGE gels

2.4.1 游離組氨酸阿魏酸對(duì)熏馬腸發(fā)酵過程中的游離組氨酸影響情況如圖2 所示。 隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，各組游離組氨酸均呈上升趨勢(shì)，Zhang 等[26]在鯉魚香腸的發(fā)酵成熟過程中也發(fā)現(xiàn)游離組氨酸的這種變化趨勢(shì)。 添加阿魏酸Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組游離組氨酸與未加阿魏酸組中的組氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有明顯差異（P＞0.05），說明阿魏酸對(duì)熏馬腸發(fā)酵過程中游離組氨酸的釋放不起作用。發(fā)酵成熟期（28 d），各組熏馬腸中的游離組氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.89 mg/kg 左右，與Domínguez 等[27]在干腌小馬駒香腸中的研究結(jié)果相似。 熏馬腸發(fā)酵過程中組氨酸量的變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程：一方面，蛋白酶不斷水解蛋白質(zhì)生成組氨酸，組氨酸量增加；另一方面，微生物生長(zhǎng)消耗部分組氨酸產(chǎn)生組胺。 但是本實(shí)驗(yàn)中組胺的生成與游離組氨酸的減少之間不成正比關(guān)系，這與Nie 等[28]在鯉魚香腸中的研究結(jié)果相似。

圖2 阿魏酸對(duì)新疆熏馬腸成熟過程中游離組氨酸的影響Fig. 2 Changes of free histidine contents in Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening affected by addition of ferulic acid at different concentrations

2.4.2 組胺由圖3可知，熏馬腸發(fā)酵過程組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，Lu 等[19]在熏馬腸中也發(fā)現(xiàn)組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的這種變化趨勢(shì)。 發(fā)酵初期（0 d） 時(shí)，4 組熏馬腸中的組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很少，說明選擇的原料肉安全性很高。 在發(fā)酵第7 天時(shí)，對(duì)照組的組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到111.12 mg/kg， 超出了Nout 等[29]指出香腸制品中組胺的允許水平100 mg/kg。 在發(fā)酵后期（第28 天），300 mg/kg 添加量時(shí)組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.71 mg/kg，相對(duì)于對(duì)照組降低了43.26%，為組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的一組。 李彬彬等[14]也在熏馬腸中添加250 mg/kg 的大蒜精油，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期， 組胺量較空白對(duì)照組降低了66.64%，張惠超等[30]在熏馬腸中接種生物胺氧化酶菌作為發(fā)酵劑，發(fā)現(xiàn)生物胺氧化酶菌具有較好的氧化組胺能力，其中以腐生葡萄球菌最為顯著，與對(duì)照組相比降低了49.28%。雖然阿魏酸對(duì)組胺量的減少低于大蒜精油和生物胺氧化酶，但是阿魏酸作為天然植物提取物，對(duì)癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)性疾病等都具有廣泛的治療作用，在發(fā)酵香腸中具有很好的應(yīng)用前景。 100 mg/kg 阿魏酸降低組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的作用均不如300 mg/kg 與500 mg/kg 明顯，300 mg/kg 與500 mg/kg 的組間差異不顯著（P＞0.05）。所以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 mg/kg 的添加量更適合應(yīng)用于熏馬腸的生產(chǎn)。 4 組熏馬腸終產(chǎn)品中組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于FDA 限量標(biāo)準(zhǔn)，大量研究也曾得到組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)在其他類發(fā)酵香腸中較低，但是熏馬腸中的組胺仍是大家值得關(guān)注的問題，因?yàn)楦泛褪吩谝欢l件下能夠增強(qiáng)組胺的毒性[31]。 添加阿魏酸后，熏馬腸中產(chǎn)組胺微生物的生長(zhǎng)受到抑制（圖1），所以組胺量明顯降低（P＜0.05）。

圖3 阿魏酸對(duì)新疆熏馬腸成熟過程中組胺的影響Fig. 3 Changes of histamine contents in Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening affected by addition of ferulic acid at different concentrations

3 結(jié) 語

阿魏酸對(duì)熏馬腸發(fā)酵過程中的水分含量、pH值以及游離組氨酸的變化無顯著差異（P＞0.05）。 阿魏酸能顯著（P＜0.05）抑制腸細(xì)菌、微球菌/葡萄球菌以及假單胞菌屬的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)乳酸菌的抑制作用不顯著（P＞0.05）。 通過PCR-DGGE 分析得到，阿魏酸能夠很好地抑制產(chǎn)組胺微生物（Lactobacillus sakei，Enterobacter cloacae 和Bacillus cereus） 的生長(zhǎng)，對(duì)控制組胺在熏馬腸中的含量起到非常顯著的作用。 300 mg/kg 的阿魏酸處理組對(duì)于組胺抑制效果最好， 為30.71 mg/kg， 相對(duì)于對(duì)照組降低了43.26%，500 mg/kg次之。 所以300 mg/kg 的添加量適合應(yīng)用于熏馬腸的生產(chǎn)。