郭洪偉， 馬慧嬌， 郭家俊， 曾朝瑋， 章 中

（寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川750021）

芽孢是細菌營養(yǎng)體在缺乏營養(yǎng)的條件下形成的休眠態(tài)，對輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學物質(zhì)等各類殺菌處理有極端抗性[1-2]，是導致食品腐敗變質(zhì)的根本原因。 芽孢萌發(fā)后失去其極端抗性，有許多因素能誘導芽孢的萌發(fā)，如營養(yǎng)素、超高壓、陽離子表面活性劑、機械擦傷、外源DPA（2，6-吡啶二羧酸）、外源裂解酶等[3]。 芽孢中最常見的皮層裂解酶是CwlJ 和SleB， 這2 種酶位于芽孢內(nèi)膜和外膜上，它們對芽孢的萌發(fā)具有專一性。 芽孢被激活后，這2 種酶將芽孢皮層水解然后導致芽孢核心的完全水化。無論是CwlJ 或SleB 都可使皮層降解，缺乏這2 種酶其皮層便無法降解和無法完成萌發(fā)。Brown W C[4]等報道pH＜7 的N-乙酰胞壁酸會抑制芽孢孢子的萌發(fā)，該抑制劑還抑制了2 種萌發(fā)相關酶的活性。Blocher J C[5]等報道在pH 值為6.5 時，添加山梨酸完全抑制了肉毒梭菌孢子的萌發(fā)， 在pH值為5.5 時， 未添加山梨酸的菌株孢子的萌發(fā)并沒有受到抑制作用。 Sheng S 等[6]報道枯草芽孢桿菌孢子CotA 的最大活性保持在pH 值為4～5 之間，可以用于固定孢子的惰性基質(zhì)中， 在制備生物催化劑中，產(chǎn)率可以大大提高。 Porebska I 等[7]報道芽孢桿菌孢子在酸性果汁中的萌發(fā)受到了抑制。 但是萌發(fā)程度取決于菌種和時間、 孵化和使用的營養(yǎng)化合物，并不全取決于pH。 由此可知，酸性條件會對菌體的生長和活性有影響，對細菌芽孢的萌發(fā)有一定的抑制作用，但其抑制機理是什么，是不是因為酸抑制了芽孢皮層裂解酶的活性，這尚不清楚，有待于深入研究。 目前國內(nèi)外研究芽孢皮層裂解酶的相關報道極少， 且未見關于pH 處理對芽孢皮層裂解酶活性和結構影響的相關報道，故推斷存在2 種可能性：其一是酸性pH 值對皮層裂解酶有抑制作用，這種抑制作用導致細菌芽孢不萌發(fā)； 其二是酸性pH 值對皮層裂解酶無抑制作用，酸抑制芽孢的萌發(fā)另有原因。

目前，傅立葉變換紅外吸收光譜儀（FT-IR）有高靈敏度、高分辨率、高效掃描及高度計算機化等長處， 是研究蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵的一種有效方法，常用來估測多肽和蛋白質(zhì)二級結構[8-10]。熒光分光光度計能夠掃描液相熒光標記物發(fā)射出的熒光光譜，近年來經(jīng)常被用來分析蛋白質(zhì)的三級結構。 酶有最適的pH 值范圍，并且對酸堿度的調(diào)節(jié)極其敏感，pH值能導致鹽橋的變化，并加強其三級結構，故利用這些儀器研究不同pH 處理后皮層裂解酶（CwlJ）的結構變化非常有必要。

為研究酸性pH 值對芽孢萌發(fā)的抑制機理，本文作者從研究pH 處理對皮層裂解酶（CwlJ）的活性的影響規(guī)律著手，結合酶結構變化的研究，分析皮層裂解酶 （CwlJ） 的活性和結構是否受pH 值的影響，進而揭示酸性pH 值對芽孢萌發(fā)的抑制機理，這對研究芽孢的萌發(fā)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮層裂解酶CwlJ（純度＞90%）：南京鐘鼎生物技術有限公司產(chǎn)品；脫芽孢衣溶液，作者所在實驗室制備；Tris-HCl 緩沖液： 北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；溴化鉀（色譜純）：美國Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

Spectrum Two 型紅外光譜儀：美國PerkinElmer公司產(chǎn)品；Scientz-1LS 真空冷凍干燥離心濃縮儀：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱： 上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；XMTD-6000 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠制造；UV-2450 型紫外可見分光光度計： 日本島津公司產(chǎn)品；970CRT 熒光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 CwlJ 凍干粉的前處理將CwlJ 凍干粉混入摩爾濃度為0.02 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液中， 配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的酶溶液，為pH 的處理，測酶活和酶的二三級結構提供原材料。

1.3.2 pH 處理CwlJ 酶溶液用稀HCl 和稀H2SO4調(diào)節(jié)其溶液體系的pH 值，將CwlJ 溶液分別處理成pH 3、5、7、9、11 的酶溶液體系。

1.3.3 酶活性的測定CwlJ 的酶活計算方法可用Makino[11]的方法。在32 ℃下，通過測出1 cm 光路內(nèi)脫芽孢衣的芽孢懸浮液的OD600值的減少量來分析酶活。 反應終產(chǎn)物體積為5 mL，包含1 mL 脫芽孢衣芽孢混合液和4 mL 酶液， 酶液包含Tris-HCl 緩沖液和皮層裂解酶CwlJ，酶活性單位（U/L）定義為：每分鐘OD600值降低0.001 所需的酶量。 每10 min測一次OD600值， 根據(jù)80 min 內(nèi)OD600值變化量計算酶活。

計算公式為：

式中：X 為酶活（U/L）；t 為反應時間（min）；V 為參與反應的酶量（mL）。

1.3.4 傅立葉紅外光譜分析采用KBr 壓片法制樣[12]：溴化鉀達到色譜純純度，溴化鉀取200 mg，樣品取2 mg，在瑪瑙研缽中研磨，在170 ℃烘箱中烘24 h 以上，干燥密封保存。 用無水乙醇酒精棉球對傅立葉紅外變換光譜儀以及研缽等器皿進行消毒。使用波長為400～4000 nm 的傅立葉紅外變換光譜儀對CwlJ 進行全波段掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1，每個樣品測量重復3次，取平均值。

1.3.5 FT-IR 譜圖處理選用Omnic 8.0 軟件處理， 采集酰胺I 帶的波段， 進行FT-IR 去卷積，標峰，做基礎紅外光譜圖分析。 利用Peakfit 4.12 軟件對譜峰進行標準化，平滑，去基線，求二階導數(shù)，尋找峰， 在二階導數(shù)原譜和酰胺I 帶紅外原譜的基礎上進行Gauss Amp 連續(xù)擬合，進行多次擬合使殘差值最小化（R2≥0.999），直至R2值不變?yōu)橹筟13]。 得到子峰數(shù)目為9～13 之間， 確定各個子峰的峰面積與CwlJ 的二級結構之間的比例關系，根據(jù)峰面積計算各種條件下峰的二級結構歸屬[14]。

1.3.6 熒光光譜分析配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的CwlJ 溶液，掃描其熒光值。 設定熒光分光光度計條件： 掃描范圍為200～500 nm， 掃描速度為200 nm/min，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為10 nm，響應時間為0.1 s，記錄數(shù)據(jù)波長間隔為1 nm。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有實驗最少重復3次，再用統(tǒng)計軟件Origin 9.0 作圖和分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 不同pH 處理對CwlJ 的活性的影響

在最適反應溫度32 ℃的條件下， 分別測定不同pH 值（3、5、7、9、11）的體系中CwlJ 的活力，確定最適反應pH 值[15]。 CwlJ 會造成脫芽孢衣芽孢的萌發(fā)，芽孢萌發(fā)時，其核心水化，造成折光性發(fā)生變化，表現(xiàn)為脫芽孢衣溶液的OD600值明顯下降，下降水平越大，芽孢的萌發(fā)率就越高，皮層裂解酶活性也就越高[16-17]。

CwlJ 對pH 值的變化極其敏感見圖1。 當對照是無菌水和脫芽孢衣溶液的混合液時，隨著時間的變化，對照組的OD600值基本不變；pH 值為3 和pH值為5 的OD600值下降最明顯，說明CwlJ 的活性保持較好，pH 值為5 是活性最高點；pH 值為7，pH 值為9 和pH 值為11 的OD600值的變化基本相同，都有顯著下降，但下降幅度較低，說明當溶液中酸堿度開始趨近于中性和堿性時，酶活已經(jīng)開始受到一定的抑制作用，隨著處理時間的增長，酶活的降低更顯著。 Miyata 等[18]研究發(fā)現(xiàn)：當pH 值在7.2～8.4時，皮層裂解酶活力最佳，當pH 值為4.2 時，皮層裂解酶基本失活，這一研究報道也是關于皮層裂解酶的，但實驗結果與本文有一定差異，可能因為菌種不同，本實驗是從枯草芽孢桿菌中分離純化得出的皮層裂解酶，而皮層裂解酶中有CwlJ 和SleB，皮層裂解酶的相對分子質(zhì)量，分子結構均不同，對pH變化的耐受程度也不同， 而本實驗研究的是CwlJ，所以推測皮層裂解酶中的SleB 可能會在酸性條件下失活，而CwlJ 的活性在pH 值為3～5 左右最高，非常適宜在弱酸性條件下水解芽孢皮層而導致芽孢萌發(fā)。 可以推測，在酸性pH 條件下芽孢不萌發(fā)的原因不全是因為皮層裂解酶活受到影響[19]，有可能和營養(yǎng)素受體、DPA 釋放等原因有關， 原因有待進一步研究。

圖1 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 活力的變化趨勢Fig. 1 Change trend of CwlJ activity of skin lyase under different pH treatment conditions

2.2 不同pH 處理下CwlJ 的FT-IR 譜圖的變化

利用傅立葉紅外光譜儀對不同pH 處理下的CwlJ 進行全波段掃描，得到如圖2 的FT-IR 譜圖以及各譜帶特性（表1），從圖2 中能夠看到全波段的FT-IR 譜圖的結構變化。 如圖3 可看到不同pH 處理條件下的CwlJ 的譜型基本相同， 但在3600～3300 cm－1的寬吸收峰強度不斷加強，表明不同pH處理能引起CwlJ 的分子內(nèi)和分子間的氫鍵增強。最常用的分析蛋白質(zhì)的二級結構即是在1700～1600 cm-1， 酰胺I 帶的震動頻率主要取決于C＝O之間氫鍵的性質(zhì)，隨著pH 的增大，羰基（C＝O）的伸縮震動越來越微弱， 故可觀察1700～1600 cm-1的波長范圍的變化來研究CwlJ 的二級結構。

圖2 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 的FT-IR 譜圖Fig. 2 FT -IR spectra of cortical lyase CwlJ under different pH treatment conditions

表1 FT-IR 譜圖的各譜帶特性[20-21]Table 1 Characteristics of FT-IR spectra

隨著pH 的增大，從峰形變化分析，峰形由大的波動逐漸變?yōu)樾〉牟▌樱?見圖3。 從峰位變化分析，pH 值為3 的CwlJ 的酰胺I 帶為1629.5 cm-1， 隨著pH 值的逐漸增大， 在對其進行酸堿度的調(diào)節(jié)過程中，酸堿度由pH 值為3 到pH 值為5 時，CwlJ 的酰胺I 帶向低波數(shù)方向進行不斷的平移， 紅移約0.5 cm-1，即由1629.5 cm-1移至1629.0 cm-1；當pH 值為7 時，酰胺I 帶的波數(shù)保持不變趨于穩(wěn)定狀態(tài)。隨著pH 調(diào)節(jié)為堿性狀態(tài)的過程中，從pH 值為7 調(diào)節(jié)到pH 值為9 時，CwlJ 的酰胺I 帶向高波數(shù)方向不斷的平移， 紅移約35 cm-1， 即由1629.0 cm-1移至1664.0 cm-1，紅移波數(shù)值比較大；當pH 值為9 調(diào)節(jié)到pH 值為11 時， 酰胺I 帶向高波數(shù)不斷的平移， 紅移約0.5 cm-1。 這表明CwlJ 的結構會隨著pH 的改變而改變，具有酸堿不穩(wěn)定性，這是因為蛋白質(zhì)中氨基酸肽鏈與外圍介質(zhì)構成氫鍵，當氫鍵作用較強時，C＝O 的電子云密度下降， 吸收帶向低波數(shù)紅移； 當氫鍵作用較弱時，C＝O 的電子云密度加強，吸收帶向高波數(shù)紅移[22-23]。 說明pH 處理會直接影響CwlJ 的原空間結構， 在調(diào)節(jié)酸堿度的過程中CwlJ 的分子內(nèi)氫鍵會受到影響， 對CwlJ 的活性也會產(chǎn)生抑制作用。

2.3 不同pH 處理下CwlJ 酰胺I 帶的擬合

酰胺I 帶是評價與分析蛋白質(zhì)二級結構的重要分析手段。研究表明[24]，F(xiàn)T-IR 中酰胺Ⅰ帶的峰形受蛋白質(zhì)主鏈結構即二級結構的影響，酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶與二級結構只存在間接的影響。 在蛋白質(zhì)的FT-IR 圖譜中， 蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲等二級結構對應的振動吸收峰互相折疊形成一寬峰，即酰胺Ⅰ帶[25]。在對酶進行傅立葉紅外光譜分析其二級結構時，酶的二級結構全部表現(xiàn)在酰胺I 帶圖譜中， 酰胺I 帶的二階導數(shù)表明其各個波數(shù)所對應的不同的積分面積[26]，在蛋白質(zhì)的二級結構分析中， 一般采用曲線擬合的方法，對CwlJ 酰胺I 帶進行基線修正，高斯去卷積，求二階導數(shù)，曲線擬合，求出峰面積，確定分峰數(shù)量是否正確，依據(jù)峰面積估算各二級結構的相對含量[27]。其中酰胺Ⅰ帶各峰位為：1615～1637 cm－1和1682～1700 cm－1為β-折疊特征峰；1646～1664 cm－1為α-螺旋特征峰；1637～1645 cm－1為無規(guī)卷曲特征峰；1664～1681 cm－1為β-轉角特征峰[28]。

圖3 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 的酰胺I 帶紅外原譜Fig. 3 IR spectra of the amide I band of CwlJ in the skin under different treatment conditions

圖4 為pH 值為3、5、7、9、11 的CwlJ 的酰胺I帶經(jīng)去卷積和二階導數(shù)處理后獲得的疊加峰分解為各個子峰的高斯曲線擬合峰圖。 由表2 和表3 的峰面積比例求出其結構歸屬。CwlJ 的二級結構主要組成為α-螺旋，其次是β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲； 大小為α-螺旋＞β-折疊＞β-轉角＞無規(guī)則卷曲。經(jīng)過pH 處理后的CwlJ 的二級結構發(fā)生如下變化：1） 隨著pH 的增大，α-螺旋先增大后減小，pH 值從3 到9，α-螺旋逐漸增大；pH 值從9 到11，α-螺旋不斷的減小。α-螺旋是蛋白質(zhì)的二級結構中最穩(wěn)定的，隨著pH 的增大，蛋白質(zhì)的二級結構發(fā)生重新排列[29]，蛋白質(zhì)的結構穩(wěn)定性下降，直接導致CwlJ 的α-螺旋中的C＝O 雙鍵電子云密度不穩(wěn)定， 氫鍵直接斷裂并與其他極性基團發(fā)生氫鍵鍵合，發(fā)生解螺旋，影響皮層裂解酶CwlJ 活性中心的構象，活性變低；2）隨著pH 的增大，無規(guī)則卷曲狀態(tài)先增大后減小，pH 值從3 到7，無規(guī)則卷曲狀態(tài)由15.13%增加到17.18%，pH 值從7 到9， 無規(guī)則卷曲狀態(tài)由17.18%降低到15.46%， 表明隨著pH 的增加，CwlJ的二級結構先從有序狀態(tài)逐漸向無規(guī)則狀態(tài)轉化，當pH 值達到7 以上時，CwlJ 的二級結構即從無規(guī)則狀態(tài)逐漸向有序狀態(tài)轉化[30]。 由此可證明pH 處理可能會導致CwlJ 發(fā)生水解， 空間結構呈無序狀態(tài)，造成酶活降低；3）隨著pH 的增大，β-轉角先減小后增大，pH 值從3 到5，β-轉角由22.43%降低到19.37%，當pH 值從5 到11，β-轉角由19.37%增加到21.38%，β-轉角本身屬于無序結構， 經(jīng)處理后，β-轉角結構很有可能會向無規(guī)則卷曲狀態(tài)轉化[31-32]。 這種轉化趨勢與高pH 處理下CwlJ 的變性和逐漸形成分散體的形態(tài)有關，外界對芽孢的一些處理條件下，芽孢的不萌發(fā)和保持休眠態(tài)的特性可能也與CwlJ 的變性以及CwlJ 的內(nèi)部結構分散有緊密的聯(lián)系；4）隨著pH 的增大，β-折疊先增大后減小，pH值從3 到7，β-折疊相對含量不斷增加，β-折疊由26.29%增加到26.31%，pH 值從7 到11，β-折疊由26.31%增加到26.76%， 由于β-折疊比較常見于蛋白質(zhì)的內(nèi)部結構區(qū)域，pH 增加使得蛋白質(zhì)發(fā)生解聚現(xiàn)象是β-折疊先增加的原因， 隨著體系完全成為堿性時，蛋白質(zhì)大分子因為堿性而聚集的現(xiàn)象導致β-折疊結構減少， 由此可推斷β-折疊結構在堿性聚集體形成的過程中起到重要作用，堿性聚集體的形成使CwlJ 的活性中心被包埋，進而導致活性降低。

圖4 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶高斯曲線擬合圖Fig. 4 Gauss curve fitting of I band of CwlJ cleavage enzyme under different pH treatment conditions

表2 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶的不同波數(shù)的二級結構相對含量Table 2 Two level structure of different bands of CwlJ amide I band of the skin lyase under different pH treatment conditions

表3 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶二級結構相對含量Table 3 Secondary structure of I band of CwlJ amide I under different treatment conditions

2.4 pH 處理對CwlJ 的熒光光譜分析

由圖5 可知，樣品在波長300～400 nm 范圍內(nèi)，各個樣品的峰位，峰形都基本沒有發(fā)生變化，λmax沒有發(fā)生紅移，說明pH 處理會導致CwlJ 的Trp 殘基暴露于親水環(huán)境中， 所以推測酶并沒有發(fā)生變性，相對來講，λmax也沒有發(fā)生藍移，說明Trp 殘基自身的微環(huán)境并沒有發(fā)生改變，熒光基團在親水環(huán)境中以相對穩(wěn)態(tài)的形式存在。 有出現(xiàn)特征峰，所有出現(xiàn)特征峰的最大激發(fā)波長均為348 nm，但是出現(xiàn)最大激發(fā)波長的峰強度顯著不同。

圖5 不同pH 處理條件下皮層裂解酶CwlJ 的熒光光譜Fig. 5 Fluorescence spectra of cortical lyase CwlJ under different pH treatment conditions

結合CwlJ 的活性實驗得出，pH 值為5 的熒光強度最強，則說明在pH 5 的條件下，CwlJ 的內(nèi)部蛋白質(zhì)完全展開，空間結構更加松散擴張，環(huán)境相對處于穩(wěn)定狀態(tài)，CwlJ 的活性較高， 其活性在這個處理條件下被完全激活， 活性中心完全暴露， 引起CwlJ 的激活效應；pH 值為11 的條件下，CwlJ 的熒光強度較強，內(nèi)部結構基本完全展開，空間結構比較疏松， 其活性減少；pH 值為7 的條件下，CwlJ 熒光強度不高，蛋白質(zhì)展開了一部分，空間結構比較緊密，活性減少的較強；在pH 值為3 和pH 值為9的條件下，CwlJ 的熒光強度非常低， 有可能是熒光基團發(fā)生過度的暴露，引起熒光猝滅，導致空間結構極其密集[33]，在pH 值為9 的條件下活性最低，但是在pH 值為3 的條件下CwlJ 的活性比較高，推測這有可能與Trp 殘基暴露于親水環(huán)境中， 肽鏈過度伸展有關。

3 結 語

實驗表明不同pH 處理會改變芽孢皮層裂解酶（CwlJ）的活性、二級結構和三級結構，CwlJ 的活性與結構呈正相關關系，結構越穩(wěn)定，活性越強。 當pH 值為3 和pH 值為5 時，CwlJ 的活性高， 當pH值為9 時，CwlJ 活性最低， 由此可推測酸對芽孢萌發(fā)的抑制作用并不是因為其抑制了CwlJ 的活性，這證明酸性pH 值抑制芽孢萌發(fā)的原因與其對皮層裂解酶（CwlJ）活性的作用無關。 本實驗推進了對細菌芽孢萌發(fā)機理的研究， 為芽孢深層機理的進一步的探究夯實了基礎。