王大明， 孫 雷， 孫文敬， 崔鳳杰， 龔勁松，張曉梅， 史勁松， 許正宏*

（1. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；3. 江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；4. 百勤異VC 鈉有限公司，江西 德興334221）

2-酮基-D-葡萄糖酸（2KGA）在合成雜環(huán)化合物、用于立體選擇性化學反應等方面具有重要應用價值[1]，已經(jīng)被成功地應用于生產(chǎn)食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其衍生物[2-4]。 目前，發(fā)酵法是最經(jīng)濟、高效且環(huán)保的2KGA 工業(yè)生產(chǎn)方法[5]。 在國際上，具有較高效率和穩(wěn)定轉化性能的假單胞菌通常用于2KGA 的工業(yè)生產(chǎn)[2，6]。變形假單胞菌（Pseudomonasplecoglossicida） JUIM01 是一株工業(yè)化生產(chǎn)2KGA的經(jīng)典菌株， 其糖酸轉化率可達理論產(chǎn)率的90%，但其生產(chǎn)強度依然不能滿足節(jié)能降耗的要求[7]。

假單胞菌的2KGA 合成途徑即發(fā)生在細胞周質空間中的葡萄糖胞外直接氧化途徑，該途徑首先需通過吡咯喹啉醌（PQQ）依賴性葡萄糖脫氫酶將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，隨后借助黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖酸脫氫酶將葡萄糖酸轉化為2KGA[6]。在這個代謝過程中，葡萄糖脫氫酶是2KGA代謝合成的限速因素[8]。 前期有文獻研究表明，惡臭假單胞菌（P. putida） KT2440 中較低的輔酶PQQ 合成水平，成為提高葡萄糖脫氫酶活性的限制因素之一[9]；Gao 等在研究提高2-酮基-L-葡萄糖酸產(chǎn)量時也發(fā)現(xiàn)，PQQ 合成水平是PQQ 依賴性脫氫酶活性的限制因素， 而引入PQQ 合成基因可提高20%的產(chǎn)物濃度[10-11]。 故推測，通過提高2KGA 工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌JUIM01 的自身PQQ 合成水平，有望進一步提高2KGA 的生產(chǎn)強度。

PQQ 作為氧化還原酶的一種輔酶，在革蘭氏G-菌中存在較為廣泛[12]。有研究表明，PQQ 來源于短肽PqqA 內部保守的谷氨酸和酪氨酸， 由這2個氨基酸側鏈交聯(lián)構成[13]。 PQQ 代謝合成的詳細機制截至目前尚未解析清楚，但可初步推測該代謝過程是由5 到6個酶促反應所構成。 其實在早期研究中已有學者推測：首先充當PQQ 代謝合成的前體，PqqA 在體內實現(xiàn)成功表達， 進而通過PqqE 識別； 隨后在PqqE 的輔助作用下，PqqA 會介導谷氨酸Glu 與酪氨酸Tyr 2 種氨基酸之間碳碳鍵的產(chǎn)生， 而這一反應過程則可由PqqF 所識別，同時PQQ 骨架還會被從PqqA 短肽上切割下來；最后，該代謝過程還會繼續(xù)借助PqqC 環(huán)化及氧化反應促使中間產(chǎn)物合成PQQ[14]。 這個合成途徑共包括4 到7個以基因簇形式存在的基因（pqqABCDEFG）[14-15]。 一些細菌具有連續(xù)的pqq基因，如氧化葡萄糖酸桿菌即由5個基因所構成，組成一個完整的基因簇（pqqABCDE）[16]；另外，據(jù)前期文獻報道，還有一些其他不同來源細菌的pqq基因則包括2個基因簇，例如扭脫甲基桿菌中含有pqqABCDE和pqqFG共2個基因簇[17]。

截至目前，涉及PQQ 生物合成途徑的編碼基因已經(jīng)在多種細菌中被鑒定獲得， 除扭脫甲基桿菌（M. extorquens）[18]外， 還有醋酸鈣不動桿菌（A.calcoaceticus）[19]、肺炎克雷伯氏菌（K. pneu-moniae）[13，20]、氧化葡萄糖酸桿菌（G. oxydans）[21-22]等多種不同細菌菌株；另外，假單胞菌屬來源的菌株還包括熒光假單胞菌（P. fluorescens）[23-25]以及惡臭假單胞菌（P. putida）[9]等。 但總結已有文獻來看，尚未見任何有關變形假單胞菌生物合成PQQ 的報道。

作者采用LA-PCR 技術克隆變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 合成基因簇， 在此基礎上明確其基因組成與生物學信息， 以期從分子水平深入探究PQQ 的生物合途徑與胞內再生機制，在此基礎上最終通過輔酶工程提高2KGA 的工業(yè)化生產(chǎn)強度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒本實驗所采用的菌株及質粒如表1 所示。

表1 本實驗所用菌株及質粒Table 1 Bacterial strains and vectors in this experiment

1.1.2 培養(yǎng)基固體活化培養(yǎng)基 （g/L）： 蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，瓊脂粉20.0；pH 7.2。

液體LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0；pH 7.0。

1.1.3 主要工具酶和試劑作者所采用的工具酶及分子生物學試劑包括Premix LA Taq 試劑及各種消化實驗所用限制性內切酶， 均購自Takara Biomedical Technology（Beijing）公司；用于基因工程操作的各類分子生物學試劑盒則購自Sangon Biotech（Shanghai）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取將活化好的JUIM01種子液接種到25 mL 的液體LB 培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)后，低溫離心去除上清液，將菌體收集并用無菌水重懸洗滌2 遍， 用于后續(xù)基因組DNA 提取操作，該實驗流程參考細菌基因組提取試劑盒操作指南進行。

1.2.2 PCR 引物的設計與合成作者所用的PCR簡并引物基于假單胞菌來源的PQQ 合成基因簇序列及NCBI 數(shù)據(jù)庫其他具有不同相似度且不同來源的假單胞菌序列，通過Primer 5.0 軟件設計而成。引物序列如下所示：

P1：5′-GCGGTACANACGTNGCTCNACGNCG-3′；P2：5′-AATCTTNCTCACANGGANGTANCGC-3′

1.2.3 目的基因片段的擴增所述1.2.1 步驟所得基因組DNA 用作模板，PCR 反應體系為（50.0 μL）：預混合使用Premix LA Taq 試劑25.0 μL， 引物P11.0 μL，引物P21.0 μL，基因組DNA 1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。 擴增反應程序設置為：在98 ℃變性10 s；延伸步驟設置為66 ℃運行10 min， 循環(huán)運行35次；最終延伸設置在72 ℃條件下運行10 min。

擴增反應所得基因產(chǎn)物采用1 g/dL 電泳進行驗證，同時，所需目的片段借助DNA 回收試劑盒進行回收，連接pMD19-T，導入E. coliDH5α 感受態(tài)；篩選陽性轉化子。

1.2.4 生物信息學分析借助ORF Finder 軟件分析基因簇中的開放閱讀框； 使用DNAMAN 及BLAST 分別分析序列數(shù)據(jù)及序列同源性； 選擇ProtParam 工具來分析目標序列的基本物理化學性質；選用PredictProtein 軟件來判斷蛋白質的二級結構；通過TMHMM 2.0 服務器研究該酶的跨膜結構；啟動子情況則是通過BPROM 和BDGP 軟件進行分析； 終止子是使用FindTerm 進行預測； 使用NCBI保守結構域檢索軟件對目標酶的氨基酸保守序列進行分析； 蛋白質的信號肽， 則使用SIGNALP 4.1分析[26]。

2 結果與分析

2.1 PQQ 合成基因簇的克隆與重組質粒的構建

作者特異性針對變形假單胞菌PQQ 合成途徑設計引物P1 和P2，同時選擇1.2.1 步驟所得基因組作為模板，通過PCR 擴增目的編碼基因。 實驗結果表明基因片段大小約為11.6 kb。 在此基礎上，本實驗進一步構建重組質粒pMD19-T-pqq，并進行限制酶消化。1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳分析結果表明，重組質粒經(jīng)單次消化后獲得大小約14 kb 的單一條帶，繼續(xù)雙酶切獲得約11.6 kb 和2.7 kb 2個條帶，具有預期的大小。 上述結果表明重組質粒pMD19-Tpqq已成功構建。

2.2 PQQ 合成基因簇的基因組成

將重組質粒 pMD19 -T-pqq送至 Sangon Biotech（Shanghai）進行測序、拼接，最終獲得基因簇的完整序列。測序結果顯示目的基因片段為11659 bp。 分析結果表明，該片段是由9個開放閱讀框組成的PQQ 合成基因簇， 其中包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH， 以及位于反向互補鏈上的pqqI，這些基因相應的編碼并合成目的 蛋 白 質 PqqF、PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE、PqqM、PqqH、PqqI。 將作者所得來源于變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 合成基因簇的核苷酸序列提交至Genbank 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MH919393。

變形假單胞菌JUIM01 與熒光假單胞菌Pf0-1和B16[23]的PQQ 合成基因簇的基因組成類似（圖1）。 同源性分析結果表明，JUIM01 與Pf0-1 等菌株的PqqF、PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE、PqqM、PqqH、PqqI 氨基酸序列一致性分別為41%、92%、84%、94%、84%、88%、65%、81%、70%（表3）。

圖1 變形假單胞菌JUIM01 與其他菌株PQQ 合成基因簇物理圖譜的比較Fig. 1 Comparison of physical map of PQQ synthesis gene clusters from P. plecoglossicida JUIM01 with those from other strains

2.3 PQQ 合成基因簇的非編碼序列分析

作者對變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 基因簇的非編碼區(qū)域進行啟動子區(qū)和終止子區(qū)的在線分析，結果顯示其中存在6 處啟動子區(qū)（具有典型的-10 區(qū)和-35 區(qū)）、7 處終止子區(qū)（具有典型的反向重復序列）和6 處核糖體結合位點（RBS） （圖2），這些預測結果將為進一步的實驗驗證以及將來的分子改造提供理論支撐。

圖2 PQQ 合成基因簇的非編碼區(qū)序列分析Fig. 2 Sequence analysis of non-coding regions of PQQ synthesis gene clusters

2.4 PQQ 合成基因簇中各基因的生物信息學分析

使用在線分析軟件， 分析了變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 合成基因簇中各不同基因的物理化學性質（表2），這9個基因所編碼的相應蛋白質沒有信號肽、沒有跨膜結構域，均屬于胞內蛋白質；各基因編碼的Pqq 蛋白質的注釋與同源比對結果見表3。各Pqq 蛋白質的保守序列分析結果具體如下：

保守序列分析結果表明，pqqF 編碼的蛋白質屬于PQQ 生物合成蛋白PqqF 家族， 該肽酶存在于PQQ 生物合成區(qū)域中， 并且被認為是作用于PQQ可能的前體肽PqqA 的蛋白酶， 其分子功能是能夠結合鋅離子，以及具有金屬肽鏈內切酶活性[24]。同源超家族分析結果顯示，第5～207 和617～756 位氨基酸屬于 “Metalloenzyme，LuxS/M16 peptidase-like”；結構域分析結果顯示， 第17～142 位氨基酸屬于“Peptidase M16，N-terminal”。

pqqA編碼的蛋白質屬于PQQ 生物合成蛋白PqqA 家族，這個蛋白質在許多物種中均存在，其大小為＜25個氨基酸， 可初步推斷出pqqA 編碼的蛋白質為輔酶PQQ 的肽前體，此外，PqqA 的保守基序“Glu-Xxx-Xxx-Xxx-Tyr”中的首尾2個氨基酸殘基Glu 和Tyr 會成為最終產(chǎn)物PQQ 的一部分[27]。

pqqB編碼的蛋白質屬于PQQ 生物合成蛋白PqqB 家族，該基因是扭脫甲基桿菌（相當于pqqG）和肺炎克雷伯氏菌的PQQ 生物合成所必需的，但對于大腸桿菌PQQ 生物合成的異源表達、醋酸鈣不動桿菌（相當于pqqV）來說不是必需的。 基于后一發(fā)現(xiàn)，表明PqqB 可能是一個轉運蛋白或一個PQQ 依賴性酶[28]，而不是用于PQQ 生物合成的酶[19]。 同源超家族分析結果顯示， 第1～303 位氨基酸屬于“Ribonuclease Z/Hydroxyacylglutathione hydrolase -like”；結構域分析結果顯示，第50～270 位氨基酸屬于“Metallo-beta-lactamase”，這些蛋白質每分子結合2個鋅離子作為輔助因子；氨基酸殘基注釋結果顯示， 含有9個推定的活性位點“88D、90Q、92D、93H、176H、177P、199G、220D”， 以及2個推定的金屬結合位點“92D、220D”。

pqqC 編碼的蛋白質屬于PQQ 合成酶類和PQQ生物合成蛋白PqqC 家族，PqqC 是一種氧化酶，其反應涉及底物的一個環(huán)閉合和八電子氧化，以產(chǎn)生PQQ[29]。同源超家族分析結果顯示，第4～251 位氨基酸 屬 于“Haem oxygenase-like，multi-helical”，該 超家族具有一個多螺旋結構域， 組成3-螺旋基序的2個結構重復[20]；結構域分析結果顯示，第14～223 位氨基酸屬于“Thiaminase-2/PQQC”。

pqqD編碼的蛋白質屬于PQQ 生物合成蛋白PqqD 家族， 它是參與輔酶PQQ 生物合成最后一步的蛋白質[30]，其分子功能是與醌結合。

pqqE 編碼的蛋白質屬于PQQ 生物合成蛋白PqqE 家族。 同源超家族分析結果顯示， 第13～289位氨基酸屬于“Aldolase-type TIM barrel”，這種TIM桶通常覆蓋整個蛋白質結構。 第11～214 位氨基酸具有“Radical SAM”結構域，以及第244～336 位氨基酸具有“4Fe4S-binding SPASM”結構域。 有證據(jù)表明， 該類蛋白質通過不尋常的Fe-S 中心來還原性裂解S：-腺苷甲硫氨酸（SAM）而產(chǎn)生自由基[31]。 盡管 PqqE 具有變體形式， 但該家族的“CxxCxxxxxCxxxC”基序幾乎不變。

pqqM編碼的蛋白PqqM 的第351～610 位氨基酸是屬于α/β 水解酶家族，含有8 條通過螺旋連接的鏈；第403～609 位氨基酸具有肽酶S9、脯氨酰寡肽酶活性位點結構域；該蛋白質具有絲氨酸型肽酶活性，可進行蛋白質水解。

pqqH編碼的蛋白PqqH 屬于LysR 家族轉錄調控因子， 其中第1～91 位氨基酸屬于翼狀螺旋DNA結合蛋白家族，該家族的共同特征是具有一個翼狀螺旋-轉角-螺旋DNA 結合基序，其中“翅膀”或環(huán)狀結構是小的β 折疊。 翼狀螺旋基序由2個翼（W1、W2）、3個α 螺旋（H1、H2、H3）和3個β 折疊（S1、S2、S3）按H1-S1-H2-H3-S2-W1-S3-W2 順序排列組成[32]。 DNA 識別螺旋使序列特異性DNA 與DNA 的主要溝槽接觸，而“翅膀”通常是與DNA 的小溝槽或骨架接觸。 一些翼狀螺旋蛋白具有裸露的疏水殘基片段，可介導蛋白質-蛋白質相互作用。 第91～293 位氨基酸具有底物結合結構域，并且類似于周質結合蛋白[33]。氨基酸殘基注釋結果顯示，二聚界面 的 結 合 位 點 是107P、108Q、110L、111E、114R、118P、120L、121V、122V、123Q、124I、125Y、126E、218E、219A、220E、221M、222N、223N、229D、230S、232A、233H。

pqqI 編碼的蛋白PqqI 屬于氨基轉移酶類型III家族，該氨基轉移酶與其他磷酸吡哆醛依賴性酶具有某些相同的機制特征，例如磷酸吡哆醛基團與賴氨酸殘基進行共價結合。 氨基酸殘基注釋結果顯示， 抑制劑-輔因子結合口袋位點為129S、130G、131A、162C、163H、165R、213E、246D、248V、249Q、275K； 吡哆醛5'-磷酸結合位點為130G、131A、162C、163H、213E、246D、249Q、275K； 催化殘基位點為275K。

表2 變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 合成基因簇中各基因的基本理化性質分析Table 2 Analysis of basic physical and chemical properties of genes in PQQ synthesis gene clusters of P. plecoglossicida JUIM01

表3 變形假單胞菌JUIM01 的Pqq 蛋白編碼基因的注釋Table 3 Annotation of P. plecoglossicida JUIM01 genes encoding Pqq proteins

3 結 語

本研究中通過生物信息學手段對數(shù)據(jù)庫中不同來源假單胞菌的PQQ 生物合成基因簇進行分析，進一步設計引物，并采用LA-PCR 技術，首次克隆到了含有2KGA 工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 合成操縱子完整序列的基因簇，該11659 bp 基因片段含有9個開放閱讀框pqqFABCDEMHI，編碼PQQ 生物合成的前體短肽PqqA 和合成途徑的相關酶。 基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)的生物信息學分析為2KGA 工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌JUIM01 的PQQ 生物合成途徑和胞內再生機制的研究奠定了基礎，進而為通過提高該菌株的自身PQQ 合成水平，來進一步提高2KGA 的生產(chǎn)強度提供理論支撐。