崔 靜， 李 濤， 丁 巍， 趙永騰， 余旭亞

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

蝦青素具有淬滅單線態(tài)氧的能力，是一種具有強(qiáng)抗氧化特性的萜類化合物，被作為添加劑廣泛應(yīng)用于食品和水產(chǎn)生物的養(yǎng)殖中[1-2]。 在脅迫條件下，雨生紅球藻會(huì)大量合成蝦青素，被公認(rèn)為是天然蝦青素的最佳生物來(lái)源[3-4]。 蝦青素作為一種具有強(qiáng)抗氧化特性的物質(zhì)，其生物合成是雨生紅球藻抵抗生物或非生物脅迫的一種防御作用[5-6]。 雨生紅球藻中蝦青素含量的積累，對(duì)提高其響應(yīng)外界脅迫的防御作用尤為重要。

MLT 是一種新的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑，可提高植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的耐受性[7]。Shi 等[8]的研究顯示，外源添加MLT 處理病原菌Pst DC3000 侵染的擬南芥葉片，可增加NO 生成及SA相關(guān)基因的表達(dá)，增加對(duì)病原菌的抗性。 雨生紅球藻作為一種真核單細(xì)胞綠藻， 在脅迫條件下，MLT對(duì)蝦青素積累的作用，及其與藻細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子之間的相互作用仍未見(jiàn)報(bào)道。

包括微藻在內(nèi)的真核生物中，在外部環(huán)境刺激下，各種信號(hào)通路會(huì)開(kāi)啟或關(guān)閉，并逐級(jí)放大或相互關(guān)聯(lián)，從而調(diào)控生物體內(nèi)的復(fù)雜生理活動(dòng)。 NO 作為一種多用途的細(xì)胞信號(hào)效應(yīng)器，它在不同的代謝過(guò)程中起著重要作用， 如抗生物和非生物脅迫，調(diào)節(jié)激素信號(hào)傳導(dǎo)等[9]，是生物體內(nèi)一種重要的信號(hào)分子。 有絲分裂激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，在各種真核生物的復(fù)雜生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，NO 和MAPK 信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能發(fā)揮了核心作用[10]，但是在微藻中，關(guān)于這些信號(hào)級(jí)聯(lián)的作用鮮有研究。

作者旨在缺氮聯(lián)合高光照條件下，外源添加MLT 誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素，初步闡明MLT對(duì)雨生紅球藻應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用。并利用小分子抑制劑的化學(xué)遺傳學(xué)，研究了MLT 調(diào)控NO 介導(dǎo)的MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)雨生紅球藻中蝦青素積累的影響。

1 材料與方法

1.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

雨生紅球藻Haematococcus pluvialis LUGU 由云南瀘沽湖水樣中分離純化所得[11]。以BBM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于3 L 鼓泡式光生物反應(yīng)器（直徑0.2 m，高0.3 m）中培養(yǎng)，（其中含2 L BBM 培養(yǎng)基），并以0.1 vvm 的速度通入無(wú)菌空氣，光照強(qiáng)度為2800 lx，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)后期（大約9.0×105cells/mL）。

3800g 離心5 min，無(wú)菌水洗滌2次，以去除殘留的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 將所獲的藻液沉淀，重新懸浮至缺氮的BBM（500 mL 錐形瓶，其中含360 mL 培養(yǎng)基）培養(yǎng)基中，最初的細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105cells/mL。將不同的化學(xué)小分子加入到缺氮BBM 培養(yǎng)基中（表1）。將未經(jīng)處理的藻細(xì)胞培養(yǎng)作為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行樣。以0.4 vvm 的速度通入無(wú)菌空氣，光照10000 lx，溫度保持在（28±1） ℃，室內(nèi)培養(yǎng)13 d。

表1 誘導(dǎo)蝦青素生物合成不同誘導(dǎo)子的處理濃度Table 1 Concentration of different treatments used for the induction of astaxanthin biosynthesis

1.2 藻細(xì)胞生物量、蝦青素的測(cè)定

為測(cè)定Haematococcus pluvialis LUGU 的干細(xì)胞質(zhì)量（DCW），每隔4 天取10 mL 誘導(dǎo)藻液，并3800 g 離心5 min， 所獲沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心、收集、置于EP 管中，儲(chǔ)存于-20 ℃，冷凍干燥并測(cè)定質(zhì)量。

利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定蝦青素含量。取各干燥樣品10 mg，充分研磨，然后用丙酮∶氯仿（1∶1，V/V） 溶液提取干藻粉中蝦青素，4 ℃條件下，12000 g 離心5 min。 多次重復(fù)此過(guò)程，至藻細(xì)胞呈白色。 將提取后的溶液置于45 ℃真空干燥箱完全干燥。 隨后用1 mL 甲醇∶二氯甲烷（3∶1，V/V）溶液溶解干燥的提取物，HPLC 上樣檢測(cè)。 其中，HPLC 條件為：流動(dòng)相A 為丙酮，流動(dòng)相B 是體積比為9∶1 的甲醇∶水； 洗脫梯度為：B 80%～20%25 min，B 20% 10 min，B 20%～80% 15 min，進(jìn)樣量20 μL， 流速為1.25 mL/min。 光譜掃描波長(zhǎng)范圍為250～700 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為476 nm。 用液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蝦青素質(zhì)量濃度c（mg/L），蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：

其中，P 為蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，（mg/g）；DCW 為干細(xì)胞質(zhì)量濃度，（g/L）。

1.3 藻細(xì)胞內(nèi)NO 的檢測(cè)

用雙胺熒光素（DAFM-FM DA）檢測(cè)NO 水平[12]。將新鮮藻細(xì)胞（1×106cells/mL）離心、洗滌，加入5 μmol/L DAF-FM DA，避光、恒溫37 ℃條件下，置于HEPES/PBS 緩沖液（pH 7.4）中振蕩孵育20 min。 離心、洗滌，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集藻細(xì)胞熒光圖片； 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)微藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計(jì)算NO 含量。

1.4 總蛋白質(zhì)提取和蛋白免疫印跡

取新鮮藻液5 mL，3500 g 離心10 min，將沉淀物懸浮于Tris 緩沖鹽溶液 （TBS， 濃度50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4， 濃度150 mmol/L NaCl，pH 7.5）中。 12000 g 離心5 min，并將沉淀物加入含有濃度1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），體積分?jǐn)?shù)0.2%聚乙烯吡咯烷酮， 體積分?jǐn)?shù)2.0% 2-巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 磷酸酶抑制劑復(fù)合物I 和1 mmol/L PMSF 的提取液中。 4 ℃勻漿研磨，12000 g 離心30 min 得到總蛋白質(zhì)提取液。 根據(jù)Bradford[13]法測(cè)定上清液中總蛋白質(zhì)的含量。上清液儲(chǔ)存于-80 ℃。

樣品蛋白質(zhì)通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)12% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。 將膜置于5 g/dL 脫脂奶粉TBST 溶液中封閉1 h， 然后放入含有p38MAPK抗體的抗血清溶液中4 ℃孵育過(guò)夜后， 用TBST 洗滌， 隨后用1∶1000 稀釋度的抗兔免疫球蛋白G 的辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗體孵育2 h[14-15]。 通過(guò)使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒使抗原抗體復(fù)合物可視化，進(jìn)而得到MAPK 蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.5 RNA 提取及基因表達(dá)量的檢測(cè)

使用TriZol 試劑提取總RNA。利用RT-PCR 試劑盒（TaKaRa）對(duì)1 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，使用ABI 7500 熒光定量?jī)x分析dxs和chy 相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。表2 為內(nèi)參基因18 S 和dxs、chy 的熒光定量引物。 其中內(nèi)參基因的作用即作為內(nèi)標(biāo)以調(diào)節(jié)RNA 的用量和循環(huán)數(shù)， 使內(nèi)標(biāo)基因在誘導(dǎo)條件下的表達(dá)豐度一致。qRT-PCR 數(shù)據(jù)結(jié)果用2-ΔΔCt[16]的方法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。 采用ANOVA（SPSS 20.0）一步法分析所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，分析不同試驗(yàn)的組間差異，當(dāng)p＜0.05 時(shí)具有顯著性意義，p＜0.01 具有極顯著性意義。

表2 酶基因熒光定量引物Table 2 Primers of Enzyme genes for qRT-PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理對(duì)雨生紅球藻生物量和蝦青素積累的影響

不同誘導(dǎo)方法對(duì)雨生紅球藻生物量和蝦青素積累的影響見(jiàn)圖1，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所有實(shí)驗(yàn)組的生物量呈上升趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)13 d 的培養(yǎng)，對(duì)照組、MLT 組和SNP 組的生物量分別達(dá)到了0.61、0.59、0.70 g/L。 MLT 結(jié)合cPTIO 組和MLT 結(jié)合U0126 組的雨生紅球藻生長(zhǎng)受到抑制，與對(duì)照組相比，生物量分別降低22.95%和26.23%。

生物量增加的同時(shí)，蝦青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在所有實(shí)驗(yàn)組中也顯示出不同程度的提高。 如圖1 （b）所示，在0～13 d 培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)照組蝦青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.36 mg/g。 在外源添加MLT 后，細(xì)胞內(nèi)的蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速增加至32.37 mg/g， 與對(duì)照組相比，增加了2.25 倍。 在SNP 誘導(dǎo)組中，蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也明顯比對(duì)照組更高， 并在13 d 后達(dá)到峰值19.69 mg/g。 相比之下，cPTIO 和U0126 的預(yù)處理導(dǎo)致了蝦青素的積累減少， 最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.04 mg/g 和9.03 mg/g。

圖1 不同處理對(duì)再生紅球藻生物量和蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 1 Effects of different treatments on biomass and astaxantin content of H.plunalis

2.2 不同誘導(dǎo)方法對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平的影響

生物體內(nèi)，NO 是參與多種生理活動(dòng)的信號(hào)分子。為了確定MLT 對(duì)蝦青素積累的調(diào)控機(jī)制是否依賴NO 對(duì)脅迫的反應(yīng)，應(yīng)用MLT、SNP（NO 供體）和MLT 結(jié)合cPTIO （NO 消除劑）3 種處理方式處理雨生紅球藻，另設(shè)有對(duì)照組。不同誘導(dǎo)方法對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平的影響如圖2 所示。 相比對(duì)照組，MLT 處理組和SNP 處理組的NO 水平顯著增加，而MLT 結(jié)合cPTIO 處理組細(xì)胞內(nèi)NO 水平顯著降低。

圖2 不同處理對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平的影響Fig. 2 Effects of different treatments on nitric oxide levels in H.pluvialis

2.3 不同誘導(dǎo)方法對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)MAPK 的影響

MAPK 是將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在許多真核生物的生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)作用，參與細(xì)胞內(nèi)多種代謝過(guò)程[17]。 Western blotting 檢測(cè)MAPK表達(dá)水平的結(jié)果如圖3 所示。 當(dāng)利用不同化學(xué)分子誘導(dǎo)藻細(xì)胞后，在第5 天MAPK 的含量顯示出顯著差異。 相比對(duì)照組，MLT 誘導(dǎo)組和SNP 誘導(dǎo)組的MAPK 水平顯著提高， 而MLT 結(jié)合cPTIO、MLT 結(jié)合U0126 處理組的MAPK 表達(dá)水平被明顯抑制。至第13 天，與第5 天的水平相比，所有組的MAPK 含量均增加；相比之下，MLT 結(jié)合U0126 組，MAPK 水平仍然低于其他組，蝦青素的合成也受到抑制（圖1（b）），源于U0126 對(duì)MAPK 的抑制作用。

圖3 不同處理對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)MAPK 的影響Fig. 3 Effects of different treatments on MAPK in H.pluvialis cells

2.4 不同誘導(dǎo)方法對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

環(huán)境脅迫條件下，外源化學(xué)物質(zhì)或植物激素的添加，可調(diào)節(jié)微藻中與蝦青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量[18]。為了確定缺氮聯(lián)合高光條件下，MLT 對(duì)雨生紅球藻蝦青素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在誘導(dǎo)5 d 和13 d，對(duì)藻細(xì)胞蝦青素合成關(guān)鍵基因dxs 和chy 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)、分析。 圖4 顯示，第5 天的cPTIO 誘導(dǎo)組中，上述2 種基因表達(dá)水平均相對(duì)較低。 在第13 天，MLT 誘導(dǎo)組和SNP 誘導(dǎo)組，dxs 和chy 的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照相比均表現(xiàn)出顯著性增加，達(dá)到最大轉(zhuǎn)錄水平。 其中，在MLT 處理組與對(duì)照組相比，dxs 和chy的最大轉(zhuǎn)錄水平分別提高了1.95 和1.74 倍；在SNP 組，dxs 和chy 的最大轉(zhuǎn)錄水平均是對(duì)照組的1.32 倍。 然而，在cPTIO 誘導(dǎo)組中，2 種基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低。

2.5 討論

研究表明，在脅迫條件下，雨生紅球藻會(huì)大量積累蝦青素，生物量也會(huì)受到一定影響[19]。在本研究中，MLT 誘導(dǎo)組生物量與對(duì)照組相比， 沒(méi)有顯著差異。 這一結(jié)論與之前的研究結(jié)果相似，強(qiáng)光照條件下添加MLT 可以抑制萊茵衣藻生物量的降低[20]。 周永斌等[21]發(fā)現(xiàn)SNP 對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及幼苗的根長(zhǎng)、 葉綠素含量和生物量有明顯的促進(jìn)作用，且Giba 等[22]也發(fā)現(xiàn)NO 消除劑可抑制皇后樹種子萌發(fā)而SNP 則促進(jìn)種子萌發(fā)。 由于藻類和植物的相似性，我們的結(jié)果也與之相似，作為NO 的供體，SNP的添加促進(jìn)了雨生紅球藻的生長(zhǎng)，生物量質(zhì)量濃度達(dá)到了0.70 g/L；NO 清除劑-cPTIO 的添加和MAPK抑制劑-U1026 的添加均抑制了雨生紅球藻的生長(zhǎng)。

圖4 不同處理對(duì)dxs、chy 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the transcription level of dxs，chy

一些化合物， 作為代謝的啟動(dòng)因子或增強(qiáng)子，能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，可以應(yīng)用于雨生紅球藻以促進(jìn)蝦青素的積累[23-24]。 近年的研究表明，茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、赤霉酸（GA3）、脫落酸（ABA）、黃腐酸（FA）和2，4-表油菜素內(nèi)酶（EBR）均可以增強(qiáng)蝦青素的積累[25-26]。 MLT 作為一種信號(hào)分子和抗氧化劑，其外源添加也顯著促進(jìn)了雨生紅球藻蝦青素含量。 在脅迫條件下，MLT 可能是以增強(qiáng)雨生紅球藻中蝦青素積累的方式響應(yīng)外界刺激，提高雨生紅球藻對(duì)外界脅迫的抵御能力。 另外，SNP 誘導(dǎo)組的蝦青素含量得到提升，MLT 結(jié)合cPTIO 和U0126的處理導(dǎo)致了蝦青素的積累減少，推測(cè)蝦青素的積累可能與藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平有關(guān)， 而NO 作為信號(hào)分子可能是通過(guò)激活了MAPK 信號(hào)通路從而提高了蝦青素積累量[27]。

通過(guò)測(cè)定雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的NO 含量， 發(fā)現(xiàn)MLT 處理組和SNP 處理組的NO 水平提高，MLT 結(jié)合cPTIO 處理組細(xì)胞內(nèi)NO 含量顯著降低，相應(yīng)地，蝦青素積累量也顯著降低（圖1（b））。這一結(jié)果表明蝦青素的積累與藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平有關(guān)，且MLT 調(diào)控雨生紅球藻對(duì)外界脅迫的作用依賴于NO 的介導(dǎo)。

為了驗(yàn)證NO 作為信號(hào)分子是否通過(guò)激活MAPK 信號(hào)通路，從而提高蝦青素積累量，即MAPK是否為NO 在藻細(xì)胞中的一個(gè)重要靶點(diǎn)， 本研究借助Western blotting 檢測(cè)了MAPK 的表達(dá)水平。結(jié)果表明，MAPK 抑制組中，MAPK 含量顯著低于對(duì)照組，蝦青素的合成受到抑制（圖1（b））。 NO 清除組中，MAPK 水平?jīng)]有受到抑制，蝦青素合成同樣受到抑制（圖1（b）），表明藻細(xì)胞內(nèi)NO 水平可通過(guò)影響MAPK 含量影響雨生紅球藻中蝦青素的積累。

Neill[28]和Asai[29]的研究結(jié)果顯示，NO 信號(hào)的傳遞與MAPK 信號(hào)通路有關(guān)，如：NO 處理能誘導(dǎo)擬南芥懸浮細(xì)胞4.7×104的MAPK 活性增高。 Pagnussat等[30]的研究也表明，外源NO 和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)黃瓜不定根形成過(guò)程中激活了4.8×104MAPK 活性，而NO清除劑-cPTIO 不僅能抑制該激酶活性的增加，而且能抑制外源NO 和生長(zhǎng)素對(duì)不定根形成的誘導(dǎo)作用，證明了NO 激活MAPK 信號(hào)通路是生長(zhǎng)素誘導(dǎo)不定根形成必需的。

Shi 等[31]發(fā)現(xiàn)MLT 可誘導(dǎo)高水平的NO 刺激防御相關(guān)基因的表達(dá)， 而NO 清除劑可抑制煙草和擬南芥中防御相關(guān)基因的表達(dá)。 本研究的結(jié)果與此一致，在脅迫條件下，外源MLT 的添加，提高了雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的NO 水平， 激活了依賴于NO 的MAPK 信號(hào)通路， 蝦青素的積累作為雨生紅球藻響應(yīng)外界刺激，提高其對(duì)外界脅迫的方式，蝦青素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平得到上調(diào)，從而提高了蝦青素積累量。 在許麗麗等[32]的RNA-Seq 分析表明，MLT 的處理使葡萄果實(shí)中有30個(gè)sts 基因表達(dá)上調(diào)，提高了葡萄果實(shí)和根系中白藜蘆醇的含量。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上，可提出一種褪黑素誘導(dǎo)蝦青素高效合成的信號(hào)通路模型（見(jiàn)圖5）。 高光照、氮缺陷條件下，外源添加MLT 提高了雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的NO 水平，激活了依賴于NO 的MAPK 信號(hào)通路，上調(diào)了蝦青素合成關(guān)鍵酶基因dxs 和chy 的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)了蝦青素的大量積累。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在雨生紅球藻中MAPK 是NO 作用的一個(gè)靶點(diǎn)，這為基因工程改造雨生紅球藻以提高蝦青素產(chǎn)量提供了科學(xué)的依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步研究雨生紅球藻高效合成蝦青素具有一定的理論和實(shí)踐意義。隨著MLT 誘導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素生物合成體系的建立和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的進(jìn)一步研究，分子水平調(diào)控雨生紅球藻蝦青素合成將為蝦青素生產(chǎn)提供一種有效策略。

圖5 褪黑素誘導(dǎo)雨生紅球藻在脅迫條件下積累蝦青素的信號(hào)通路假設(shè)模型示意Fig. 5 Schematic diagram of the signal pathway hypothesis model for the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis induced by melatonin under stress