廖瑩, 夏曉敏

1. 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室(中國科學(xué)院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

海洋聚球藻(cluster 5Synechococcus)是一類光合自養(yǎng)的微微型原核生物, 直徑介于0.6～1.7μm 之間, 廣泛分布于河口和海洋區(qū)域(Moore et al, 2002;馬英 等, 2004)。聚球藻光合膜外排列著許多大分子聚集體——藻膽體(phycobilisomes, PBSs), 其功能是捕獲并將已捕獲的光能傳遞給類囊體上的葉綠體a進行光合作用(Yamanaka t al, 1981; 路榮昭 等,1991)。根據(jù)藻膽體組成結(jié)構(gòu)的不同, 聚球藻可分為3 種色素類型(Callieri et al, 2002; Six et al, 2007)。Ⅰ類(type1)聚球藻只含藻藍蛋白(phycocyanobilin,PCB), 吸收紅光呈現(xiàn)綠色, 主要分布于河口區(qū)域;Ⅱ類(type2) 聚球藻同時含有藻紅蛋白(phycoerythrobilin, PEB)和PCB, 分布在相對干凈的近岸水域; Ⅲ類(type3)聚球藻同時含有藻尿膽素(phycourobilin, PUB)、PEB 和PCB, 對藍光吸收較強, 廣泛分布于外海(Xia et al, 2017, 2018)。按照PUB/PEB 的比例, Ⅲ類聚球藻又可分為3a 型(低PUB)、3b 型(中PUB)、3c 型(高PUB)、3d 型(可變PUB)和3f 型(超高PUB)(Everroad et al, 2012; Xia et al, 2017)。另一方面, 根據(jù)標記基因的序列差異, 如rpoC1 (Fuller et al, 2003; Mühling et al, 2005)和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internally transcribed spacer, ITS)(Rocap et al, 2002; Ahlgren et al, 2006), 海洋聚球藻被分為3 個主要進化亞簇(subcluster): subcluster 5.1、subcluster 5.2 和subcluster 5.3。其中, subcluster 5.1和subcluster 5.3 主要為嚴格海洋型聚球藻, 廣泛分布于外海, 而subcluster 5.2 為廣鹽型聚球藻, 是河口的重要組成部分。近期研究中subcluster 5.1 被進一步分為20 個遺傳型, 主要由Ⅱ類和Ⅲ類聚球藻組成(Xia et al, 2019)。

聚球藻具有豐富的物種多樣性, 其分布受多種環(huán)境因素影響。前期研究中發(fā)現(xiàn)聚球藻的色素類型分布與鹽度梯度緊密相關(guān), PEB 型聚球藻豐度在高鹽區(qū)域較高, 而在低鹽區(qū)域則顯著降低(Wang et al,2011)。此外, Xia 等(2017)在香港水域的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隨著鹽度增加, 聚球藻的優(yōu)勢種逐漸由PCB 型聚球藻(Ⅰ型)向PEB 型聚球藻(Ⅱ和Ⅲ型)轉(zhuǎn)變(Xia et al,2017)。而遺傳類群中, subcluster 5.2 主要分布在低鹽海域, 而subcluster 5.1-clade Ⅱ和subcluster 5.1-clade Ⅲ廣泛分布于高鹽海域。隨著生物技術(shù)的發(fā)展, 聚球藻基因組分析技術(shù)已比較成熟, Palenik 等(2003)已破譯聚球藻WH8102 的全基因組。目前,NCBI 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有30 多個相對完整的聚球藻基因組數(shù)據(jù), 但聚球藻中部分基因功能還未知, 而轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)即RNA-seq (RNA Sequencing), 可反映物種的表達信息, 得到大量功能基因表達數(shù)據(jù),對揭示基因表達與生物學(xué)過程的關(guān)系具有重要意義。因此, 通過轉(zhuǎn)錄組的比較分析, 有助于揭示河口區(qū)域聚球藻的鹽度適應(yīng)機制。

本文選取廣鹽型聚球藻K1 和嚴格海洋型聚球藻YX02-1, 對兩者在不同鹽度下的生長進行對比,并進一步通過轉(zhuǎn)錄組分析廣鹽型聚球藻K1 的耐低鹽機制, 旨在加深人們對聚球藻鹽度適應(yīng)機理的認識, 為厘清聚球藻分布和變化趨勢提供新的科學(xué)依據(jù)和預(yù)測方向。

1 材料與方法

1.1 聚球藻的分離純化

將采集的1mL 海水樣品轉(zhuǎn)至3mL 無硅f/2 培養(yǎng)基(表1)(Guillard et al, 1962), 用滅菌海水稀釋5 倍,同時加入放線菌酮(20mg·L-1)以抑制真核藻類生長,并置于25℃、光照∶黑暗=12∶12、35μmoL·m-2·s-1光照強度下培養(yǎng)數(shù)天。當培養(yǎng)基出現(xiàn)淡紅色或者淡綠色時, 采取稀釋法和平板劃線法分離純化聚球藻K1。稀釋法: 取5 個12mL 細胞培養(yǎng)管, 高溫高壓滅菌后做標記, 每個培養(yǎng)管中加入9mL 用滅菌人工海水配置的無硅f/2 培養(yǎng)基, 并加入1mL 藻液于1號培養(yǎng)管, 輕搖混勻后, 汲取1mL 混合液至2 號培養(yǎng)管, 按順序依次稀釋至5 號培養(yǎng)管, 最后放置于光照培養(yǎng)箱(Kenton, China)中培養(yǎng)。平板劃線法: 在500mL 液體無硅培養(yǎng)基中加入5g 瓊脂, 高溫高壓滅菌后制成固體培養(yǎng)平板備用, 利用接菌環(huán)或涂布棒將藻液輕輕涂抹于平板上, 置于光照培養(yǎng)箱下培養(yǎng)數(shù)天并觀察生長狀況, 以ropC1 標記基因利用PCR和流式細胞儀分析為依據(jù)驗證聚球藻是否純化成功。

表1 無硅f/2 培養(yǎng)基配方Tab. 1 The medium formula of f/2 without silicon

聚球藻YX02-1 分離自南海, 由廈門大學(xué)鄭強博士提供。

1.2 試驗設(shè)計及生理測定

試驗選用聚球藻YX02-1 和K1, 通過調(diào)節(jié)人工海水中NaCl 和MgCl2濃度設(shè)置5 個鹽度: 10‰、13‰、18‰、25‰和33‰, 并設(shè)3 個重復(fù)組, 于40mL細胞培養(yǎng)瓶中連續(xù)培養(yǎng), 培養(yǎng)條件: 25℃、光照∶黑暗=12∶12、35μmoL·m-2·s-1。培養(yǎng)過程中每24h 取1mL藻液, 利用可見分光光度計(A360, China)進行OD440測量, 并繪制生長曲線。

1.3 全吸收光譜和流式細胞分析

采用可見分光光度計測量聚球藻YX02-1 和K1的全吸收光譜(400～700nm), 并通過流式細胞儀(Becton-Dickinson FACSCalibur cytometer, Becton,Dickinson and Company, USA) 488nm 和635nm 的雙激光束測定兩種藻株的色素類型。

1.4 DNA 提取、PCR 及測序

采用 DNA 提取試劑盒(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)提取聚球藻DNA。將濾膜用無菌剪刀剪成2mm×2mm 碎片, 按照試劑盒說明書操作。DNA 提取后儲存于 TE(Tris-EDTA)緩沖液中進行洗脫, 并于-20℃冰箱中保存, 待進一步作特定功能基因rpoC1 擴增實驗。第一輪PCR 反應(yīng)采用25μL 反應(yīng)體積: 模板1μL、引物(rpoC1-N5 和rpoC1-C) 1μL、超純水9.5μL 和taqDNA 聚合酶12.5μL。首先將反應(yīng)體系處于95℃下進行10min 高溫變性, 然后進行30 個循環(huán): 95℃45s, 51℃ 45s, 72℃ 45s, 最后, 在Taq酶(72℃)作用下, 以dNTP 為原料, 合成與模板互補的DNA 鏈。第二輪采用 50μL 反應(yīng)體積: 模板 3μL、超純水18μL、taqDNA 聚合酶 25μL 和引物[rpoC1-39F(5′-GGNATTNGTNTGYGAGCGYTG-3′) 和rpoC1-462R (5′-CGYAGRCFCTGRTCAGCTT-3′)] 各 2μL(Xia et al, 2015, 2018)。擴增子通過Beckman AWPure Beads 純化后, 采用Agilent 2100 Bioannlyzer 定量并于Illumina Hiseq 2500 進行高通量測序。

1.5 進化樹構(gòu)建

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載除K1 外的45 株聚球藻的rpoC1 基因序列。利用MEGA7.0 軟件進行同源性分析(Kumar et al, 2016), 通過 ClustalW 對核苷酸序列進行一致性比對, 并以最大似然數(shù)(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹, 以cluster 3 (聚球藻進化簇3)序列為外群, 測試方法Bootstrap, 重復(fù)數(shù)100。

1.6 樣品收集和轉(zhuǎn)錄組分析

將培養(yǎng)在33‰和10‰并處于對數(shù)生長期的聚球藻K1, 通過0.2μm PC 膜(polycarbonate membrane,聚碳酸酯膜)過濾收集后放于1.5mL 離心管中, 加入200μL RNA Later 液氮速凍, 于-80℃超低溫冰箱中儲存等待送樣測序。提取工作由廣州美格公司承接,提取后對樣品質(zhì)量進行檢測并選取合格樣品進行文庫構(gòu)建和初步定量, 并于Illumina Hiseq 2500 平臺進行文庫測序, 獲得帶接頭的原始測序序列, 使用megahit 和Prodigal 進行基因組裝和預(yù)測處理原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)后, 利用bowtie 計算每個基因豐度, 最后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads)進行基因表達水平分析, 轉(zhuǎn)錄基因豐度升高表明基因表達水平也在提高, 通過序列數(shù)即可估計相應(yīng)基因的表達水平。另外, 將獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進行基因注釋并上傳至京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和蛋白相鄰類的聚簇數(shù)據(jù)庫(cluster of orthologous groups of proteins,COG)進行序列比對和富集分析。

1.7 差異基因分析

通過R 語言DESeq2 進行基因差異性分析, 得到高鹽和低鹽樣本中的差異表達基因(differential expression genes, DEGs), 并取p-value<0.05 且|log2Foldchange|>1 的基因作為差異基因集, 基因上升或下降2 倍以上的進一步使用R (version 3.4.0)聚類軟件包 pheatmap 作熱圖分析, 且所有 TPM(Transcript per million, 每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本)值進行平方根處理(square root transformed, sqrt), 基因名稱、功能等通過KEGG 注釋。

1.8 數(shù)據(jù)分析

生長速度通過R (version 3.6.3)和Excel 2016 進行統(tǒng)計學(xué)分析, 以平均值及標準差形式展示(mean±sd); 通過以下公式計算生長率(μ, 單位: d-1):

式中:Nt和N0分別表示t和t0時聚球藻在440 nm 波長下的吸光值。本研究所獲得的序列數(shù)據(jù)已上傳NCBI 數(shù)據(jù)庫, 登錄號為: PRJNA723138 和MW971921, 其他聚球藻序列下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 聚球藻的生理特征

聚球藻K1 和YX02-1 在不同鹽度下的生長曲線如圖1 所示。K1 在10‰、13‰、18‰、25‰和33‰鹽度下均生長良好, 13‰時具有最高生長率(對數(shù)期), 為0.189, 33‰時生長率最低, 為0.145 (圖1b)。而YX02-1 在鹽度33‰時生長率最高, 為0.2, 10‰和13‰鹽度中無法生存, 18‰鹽度下的聚球藻生長狀態(tài)較差, 生長率為0.1 (圖1a、圖2)。結(jié)果表明K1鹽度適應(yīng)性強, 但更偏好中低鹽環(huán)境, 而YX02-1 則在≤13‰鹽度下無法生存。

圖1 聚球藻YX02-1 (a)和K1 (b)在不同鹽度(10‰、13‰、18‰、25‰、33‰)下的生長曲線Fig. 1 The growth curve of Synechococcus sp. of YX02-1 (a) and K1 (b) at different salinity (10‰, 13‰, 18‰, 25‰, 33‰)

圖2 聚球藻YX02-1 在不同鹽度(10‰、13‰、18‰、25‰、33‰)下培養(yǎng)至第8 天時的生長狀況Fig. 2 The growth of Synechococcus sp. YX02-1 cultivated for eight days under different salinity (10‰, 13‰, 18‰, 25‰,33‰)

2.2 聚球藻鑒定和進化樹構(gòu)建

聚球藻YX02-1 (圖3a)和K1 (圖3b)的全吸收光譜顯示, YX02-1 在490nm 和550nm 處存在兩個吸收峰, 分別是PUB 和PEB, 而K1 在630nm 處存在一個吸收峰, 為PCB (Six et al, 2007)。同時,流式細胞分析顯示YX02-1 具有很強的藻紅蛋白(PEB)熒光信號(圖3c), 而K1 具有較強的藻藍蛋白(PCB)熒光信號(圖 3d)。該結(jié)果表明, YX02-1為PEB 型聚球藻, K1 為PCB 型聚球藻。

圖3 聚球藻YX02-1 (a)、K1 (b)的全吸收光譜圖和YX02-1 (c)、K1 (d)的流式細胞熒光信號圖PEB: 藻紅蛋白; PCB: 藻藍蛋白Fig. 3 The total absorption spectra of Synechococcus sp. YX02-1 (a) and K1 (b) and the flow cytometric fluorescence signals of Synechococcus sp. YX02-1 (c) and K1 (d)

基于極大似然估計(maximum likelihood)方法對rpoC1 功能基因進行比對和分析, 構(gòu)建包括YX02-1、K1 在內(nèi)的46 株聚球藻的系統(tǒng)發(fā)育進化樹,進一步分析明確聚球藻的分類地位(圖4)。結(jié)果顯示,聚球藻被分為3 大類: subcluster 5.1、subcluster 5.2和subcluster 5.3, 其中, YX02-1 與WH8103 親緣性為100%, 被共同劃分為subcluster 5.1-clade Ⅲ, K1與LTW-RED、WH8007 共同組成subcluster 5.2-B。結(jié)合圖3 聚球藻色素類型分析, 可鑒定YX02-1 為PEB 嚴格海洋型聚球藻, K1 為PCB 廣鹽型聚球藻。

圖4 聚球藻系統(tǒng)發(fā)育進化樹主要分為3 個分支: subcluster 5.1、subcluster 5.2 和subcluster 5.3。聚球藻K1 由紅色圓圈標記, 聚球藻YX02-1 由藍色圓圈標記Fig. 4 The phylogenetic tree of Synechococcus being mainly divided into three groups: subcluster 5.1, subcluster 5.2 and subcluster 5.3. K1 is marked by red dot, while YX02-1 is marked by blue dot

2.3 低鹽條件下聚球藻K1 在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達

聚球藻K1 在低鹽或高鹽培養(yǎng)條件下的差異表達基因分析顯示: 以高鹽條件為對照組, 低鹽條件下顯著上調(diào)基因共227 個, 下調(diào)基因70 個, 并且差異性基因主要參與碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在低鹽條件下, 與滲透壓有關(guān)的基因, 包括ggpS (葡萄糖基甘油磷酸合成酶)、SPS(蔗糖磷酸合成酶)、stpA (葡萄糖基甘油3-磷酸酶)等基因豐度發(fā)生顯著下降(圖5b、圖6a)。并且聚球藻K1 的色素蛋白cpcA 和cpcB 基因, 以及光合作用中ATPF0B、ATPF0A、ATPF1D和ATPF1A等相關(guān)產(chǎn)能基因豐度, 均在低鹽條件下顯著下降,說明鹽度會影響聚球藻的光合作用(圖5b、圖6b)。此外, 代謝通路包括碳循環(huán)、硫代謝、氮代謝等也均受到鹽度影響。其中,cynT 基因作為氮代謝的重要參與者, 在低鹽培養(yǎng)條件下表達量增加?；騝oxA、coxB 和coxC 是細胞色素亞基單位, 參與氧化磷酸化, 具有將氫離子從基質(zhì)泵入細胞間隙的能力, 并產(chǎn)生ATP 供轉(zhuǎn)運者泵出滲透性成分或鐵, 以維持低鹽度條件下的滲透壓平衡, 這些基因均在低鹽條件下明顯上調(diào)。而熱休克蛋白HSP20 基因表達量上升, 這類蛋白是非生物脅迫下細胞耐受機制的重要組成部分(圖5a)。此外,FTRC基因明顯下調(diào), 該基因為鐵氧還蛋白硫氧還蛋白還原酶, 其催化生成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)可用于卡爾文循環(huán)中的固碳以及硫同化、碳同化等(圖5b)。上述基因表達量的豐度變化是聚球藻K1 適應(yīng)低鹽環(huán)境的重要內(nèi)在機制。

圖5 熱圖顯示低鹽條件下聚球藻K1 顯著上調(diào)(a)或顯著下調(diào)(b)的基因及豐度圖中H1、H2、H3 表示高鹽組; L1、L2、L3 表示低鹽組。Sqrt(TPM)表示經(jīng)過開平方轉(zhuǎn)換的TPM 值。圖中左側(cè)為基因名稱@該基因在KEGG 通路中的K 號; 右側(cè)字母為基因功能代碼, J: 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生; K: 轉(zhuǎn)錄; L: 復(fù)制, 重組和修復(fù); D: 細胞周期, 細胞分裂, 染色體分配; V: 防御機制; T: 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制; M: 細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生; N: 細胞運動; U: 細胞內(nèi)運輸, 分泌和囊泡轉(zhuǎn)運; O: 翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn), 分子伴侶; C: 能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化; G: 碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝; E: 氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝; F:核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝; H: 輔酶轉(zhuǎn)運和代謝; I: 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝; P: 無機離子轉(zhuǎn)運和代謝; Q: 次級代謝產(chǎn)物生物合成, 轉(zhuǎn)運和分解代謝; S: 未知功能Fig. 5 The heatmap showing that the gene abundance (TPM) of Synechococcus sp. K1 was significantly up-regulated (a) or down-regulated (b) at low salinity

圖6 聚球藻K1 在高鹽或低鹽培養(yǎng)條件下滲透壓有關(guān)的基因SPS、ggpS、stpA、通道蛋白基因(a)和色素蛋白基因cpcA、cpcB (b)的基因豐度(TPM)比較**表示差異極顯著(p<0.01)Fig. 6 Comparison of the abundance (TPM) of genes SPS, ggpS, stpA, channel protein (a) and pigment proteins genes cpcA,cpcB (b) under high and low salinity

2.4 鹽度對聚球藻K1 主要代謝過程的影響

聚球藻K1 在低鹽和高鹽培養(yǎng)條件下均保持著完整的代謝通路過程, 主要包括碳代謝、硫代謝和氮代謝。在碳代謝過程中, 參與葡萄糖降解的有關(guān)基因在低鹽條件下顯著上調(diào)。其中,g lk基因(glucokinase, 葡萄糖激酶)上調(diào)了約1.4 倍;G6PD(glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase, 6-磷酸葡萄糖1-脫氫酶)上調(diào)了約2 倍, 該基因是糖酵解和其他葡萄糖分解的重要參與者;PGLS(6-phosphogluconolactonase, 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶)和PGD(6-phosphogluconolactonase dehydrogenase, 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)分別上調(diào)了1.7 和1.9 倍(圖7a)。在碳代謝的其他過程中, 參與合成乙酰輔酶A 的PDHA(pyruvate dehydrogenase, 丙酮酸脫氫酶)、PK(pyruvate kinase, 丙酮酸激酶)、PGK(phosphoglycerate kinase, 磷酸甘油酸激酶)等基因表達量基本降低了1～4 倍, 其中,PGK下調(diào)最多, 約3.5 倍(圖7b)。硫代謝中, 參與異化硫酸鹽還原過程中的基因表達量均下降(該過程為圖7b 中的硫酸鹽還原為硫化物)。而在氮代謝過程中, 硝酸鹽還原為銨鹽的過程增強, 包括NRT(nitrate/nitrite transporter, 硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運子)、narB (nitrate reductase B, 硝酸鹽同化還原酶基因B)、narA (nitrate reductase A, 硝酸鹽同化還原酶基因A)在內(nèi)的基因豐度均上調(diào)了1倍左右(圖7c)。同時, CO2轉(zhuǎn)化為氨基甲酸鹽的能力加強, 基因cynT 上調(diào)了約2.8 倍,cynS 上調(diào)了約1.9倍, 但谷氨酸鹽代謝能力減弱。該結(jié)果說明鹽度對硫代謝過程的消極影響最大, 其碳代謝部分通路在低鹽下減弱, 并且還原硫酸鹽的基因也受到限制,但硝酸鹽還原為銨的能力增強, 說明K1 在河口下的生長過程需要大量的銨鹽, 這也進一步解釋了分布于河口的聚球藻對氮源的需求。

圖7 聚球藻K1 碳代謝(a)、硫代謝(b)、氮代謝(c)途徑對鹽度變化的響應(yīng)紅色圓圈代表基因上調(diào), 藍色圓圈代表基因下調(diào)。圓圈大小表示調(diào)整幅度Fig. 7 The responses of carbon metabolism (a), sulfur metabolism (b) and nitrogen metabolism (c) of Synechococcus sp. K1 to salinity changes. The red dot represents the genes of up-regulation, and the blue dot represents the genes of down-regulation

2.5 聚球藻K1 的其他調(diào)控機制

通過對比低鹽和高鹽培養(yǎng)條件下聚球藻毒素-抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin system,TA-system)的相關(guān)基因(doc、mvpA、ftsZ、EARS)豐度, 發(fā)現(xiàn)兩個試驗條件下的基因表達量幾乎沒有變化(圖8)。該結(jié)果說明TA-system 作為一種重要的防御機制, 能夠降低生長、抑制生長或者殺死細胞亞群來抵抗環(huán)境壓力, 是廣鹽型聚球藻生活在河口的重要組成, 但并不是其適應(yīng)鹽度的調(diào)控機制。

圖8 聚球藻K1 在低鹽或高鹽培養(yǎng)條件下TA-system 相關(guān)基因(doc、mvpA、ftsZ、EARS)豐度(TPM)的比較Fig. 8 Comparison of genes (doc, mvpA, ftsZ, EARS)abundance (TPM) about TA-system under low and high salinity

3 討論

前期針對河口區(qū)域聚球藻分布的研究顯示, 聚球藻的色素類型組成及群落結(jié)構(gòu)組成在河口區(qū)域具有明顯的空間差異(Xia et al, 2015, 2017, 2018)。例如在珠江口, 隨著鹽度增加, 聚球藻的主要類群從淡水類群向subcluster 5.2, 再向subcluster 5.1-cladeⅢ過渡。研究指出, 河口聚球藻群落組成的空間變化往往是由鹽度、營養(yǎng)鹽、溫度、濁度等環(huán)境要素決定(Celepli et al, 2017; Xia et al, 2017)。本研究通過對低鹽區(qū)域和高鹽區(qū)域分離得到的聚球藻進行不同鹽度條件下的生長對比, 發(fā)現(xiàn) K1 在鹽度10‰～33‰范圍內(nèi)均生長良好, 而YX02-1 在鹽度≤13‰下無法生長。這一結(jié)果進一步驗證了鹽度是影響聚球藻在河口分布格局的重要因素。此外, 我們發(fā)現(xiàn)雖然K1 在所有鹽度(10‰、13‰、18‰、25‰、33‰)下都能生長, 但是33‰鹽度下聚球藻K1 的生長率顯著低于13‰鹽度下的生長率。該結(jié)果表明K1 更偏好低鹽度, 解釋了為何廣鹽型聚球藻的豐度往往在河口中低鹽度區(qū)域較高(Xia et al, 2017)。進化分析顯示, 遺傳分類上K1 屬于subcluster 5.2, 而YX02-1 屬于subcluster 5.1 (圖4), 與Herdman 等(2001)的研究結(jié)果一致。Herdman 等發(fā)現(xiàn)subcluster 5.1 類群的聚球藻除了clade Ⅷ, 大部分都是嚴格海洋種, 而subcluster 5.2 類群的聚球藻都是能耐受低鹽的廣鹽類群(Herdman et al, 2001)。

通過轉(zhuǎn)錄組研究, 我們發(fā)現(xiàn)廣鹽型聚球藻耐受低鹽主要是通過減少細胞內(nèi)滲透壓相關(guān)小分子合成, 同時增加膜通道蛋白提高小分子物質(zhì)外排來達到細胞內(nèi)外滲透壓平衡, 這一結(jié)果與 Xia 等(2020)人的研究結(jié)論一致, 他們針對PEB 型廣鹽型聚球藻的耐低鹽機理開展研究, 發(fā)現(xiàn)該類型的聚球藻也是通過減少滲透壓調(diào)節(jié)分子合成、減少小分子向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運, 同時提高小分子外排來實現(xiàn)內(nèi)外滲透平衡。研究表明, 藍藻主要利用蔗糖、葡萄糖基甘油和甜菜堿作為滲透壓調(diào)節(jié)分子(Celepli et al,2017)。我們對生長于低鹽和高鹽下的聚球藻K1 進行轉(zhuǎn)錄組比較分析, 發(fā)現(xiàn)在低鹽條件下, 與糖酵解合成相關(guān)的基因ggpS 和stpA 基因表達量顯著下降。ggpS 和stpA 作為糖酵解催化酶, 能催化ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖基甘油(GG), 表明葡萄糖基甘油是PCB 型廣鹽型聚球藻適應(yīng)滲透壓變化的關(guān)鍵物質(zhì)。這與嚴格海洋型聚球藻及PEB 型廣鹽型聚球藻不同, 這兩類聚球藻主要是利用甜菜堿作為滲透壓調(diào)節(jié)分子(Xia et al, 2020)。在波羅的海的研究也發(fā)現(xiàn), 聚球藻甜菜堿合成基因bsmB 主要在高鹽度站位發(fā)現(xiàn), 而蔗糖合成和葡萄糖基甘油合成的基因SPS和ggpS 在所有鹽度都占有較高比例(Celepli et al, 2017)。這些結(jié)果表明使用不同的滲透壓調(diào)節(jié)分子有可能是不同聚球藻類群耐受低鹽能力差異的一個重要因素(Celepli et al, 2017)。另一方面, 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)一種具有甘氨酸拉鏈(>fig|1129.219. peg.877, Glycine zipper, GXXXGX XXG)的通道蛋白(channel protein)基因, 其豐度在低鹽條件下顯著上升(圖6a)。通過TMpred 網(wǎng)站對該蛋白序列進行預(yù)測, 結(jié)果顯示該蛋白具有跨膜雙螺旋結(jié)構(gòu)(圖9)。根據(jù)最近的研究報道, 該蛋白是一類雙向跨膜蛋白, 被命名為glzT, 是滲透壓調(diào)節(jié)機制Env/OmpR 系統(tǒng)的重要組成部分(Xia et al,2020)。該類跨膜蛋白基因glzT, 在PEB 型廣鹽型聚球藻(Xia et al, 2020)和PCB 型廣鹽型聚球藻(本研究)都有發(fā)現(xiàn), 并且在低鹽條件下表達量顯著上調(diào), 表明該蛋白普遍存在于廣鹽型聚球藻中, 與低鹽耐受密切相關(guān), 是廣鹽型聚球藻在河口低鹽環(huán)境中重要的生存機制。

圖9 TMpred 預(yù)測的基因glzT 跨膜結(jié)構(gòu)圖圖中實線表示膜內(nèi)向膜外預(yù)測; 虛線表示膜外向膜內(nèi)預(yù)測。左和右側(cè)小方框表示膜外區(qū)域Fig. 9 The transmembrane structure diagram of glzT predicted by TMpred

最后, 本研究表明降低鹽度可對聚球藻多個代謝通路產(chǎn)生影響。在低鹽條件下, 廣鹽型聚球藻的光合作用可能受到鹽度影響, 其編碼色素蛋白的基因cpcA、cpcB 以及相關(guān)產(chǎn)能基因ATPF0B、ATPF0A、ATPF1D和ATPF1A豐度均下調(diào), 這與Deshnium 等(1995)報道一致, 該研究將聚球藻從無NaCl 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含0.4mol·L–1NaCl (23.4‰)的培養(yǎng)基后, 兩天內(nèi)光合作用減弱、細胞生長緩慢,說明鹽度變化會影響聚球藻的光合作用(Deshnium et al, 1995)。Ludwig 等(2012)報道發(fā)現(xiàn)ATPF0/F1在高鹽下基因豐度上升, 該結(jié)果同樣說明鹽度會影響聚球藻光合作用(Ludwig et al,2012)。鹽度降低對聚球藻的碳代謝、硫代謝、氮代謝也可發(fā)生不同程度影響。其中, 硫代謝所受影響最大, 相關(guān)基因豐度下調(diào)了 1～2 倍左右, 但氮代謝的相關(guān)基因普遍上調(diào), 尤其是硝酸鹽還原為銨的能力增強, 說明聚球藻K1 在低鹽條件下需要較多無機氮, 與低鹽下較高的生長率相一致。

Marsan 等(2017)研究發(fā)現(xiàn), 在硝酸鹽和磷酸鹽限制下, 聚球藻CB0101 的TA-system 相關(guān)基因表達量在轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生明顯上升, 這說明TA-system 是營養(yǎng)鹽限制條件下的重要保護機制,目前已經(jīng)在廣鹽型聚球藻包括CB0101、WH5701、CB0205 中均發(fā)現(xiàn)了該系統(tǒng)(Marsan et al, 2017)。但通過對比低鹽和高鹽下聚球藻K1 的TA-system 相關(guān)基因豐度, 發(fā)現(xiàn)鹽度變化對其豐度影響較小, 該結(jié)果說明TA-system 是河口多變環(huán)境下的重要調(diào)節(jié)機制, 但可能并不是耐低鹽機制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

4 結(jié)論

本研究旨在闡明廣鹽型聚球藻K1 適應(yīng)低鹽的內(nèi)在分子機制, 通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 廣鹽型聚球藻滲透壓調(diào)節(jié)機制更完善, 其在低鹽條件下能通過降低滲透劑(葡萄糖基甘油)的生物合成、蛋白通道轉(zhuǎn)運離子、Env/OmpR 系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制等, 改變細胞內(nèi)滲透壓以維持細胞正常生長。同時, 鹽度還會影響聚球藻的光合系統(tǒng)及代謝水平。本文深入闡釋了廣鹽型聚球藻的耐低鹽機制, 但缺少與嚴格海洋型聚球藻的比較基因組分析, 后續(xù)研究需進一步結(jié)合多種研究方法, 從多方面更深入的探討聚球藻對鹽度的適應(yīng)機制。