曾媛 盧孝清 張妮 夏名英

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，包括肺鱗癌、肺腺癌和大細(xì)胞癌[1],占肺癌患者的75%～85%，患者死亡率高達(dá)89%，居所有類型惡性腫瘤首位[1]。近年來(lái)隨著放化療、生物治療、分子靶向治療等治療手段進(jìn)步，NSCLC患者預(yù)后有所改善[2]，但死亡率仍處于較高水平，因此積極探究NSCLC進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)影響因子對(duì)腫瘤臨床治療仍有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(Mesenchymal to epithelial transition factor，MET)在膽管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，與膽管癌分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。王瑾等研究表明，甲狀腺惡性結(jié)節(jié)組織中MET表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合超聲檢測(cè)對(duì)評(píng)估甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后價(jià)值較高[4]。有研究報(bào)道，結(jié)直腸癌患者外周血血栓素A2(Thromboxane A2，TXA2)水平升高，可能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移中有重要作用[5]。Li等研究證實(shí)，TXA2在人乳腺癌腫瘤及癌前病變中均有高表達(dá)，可能是調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的關(guān)鍵因子[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，分析與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，探究二者在NSCLC進(jìn)展中作用，為臨床患者病情及預(yù)后判斷提供一定理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2009年6月～2014年6月本院收治的NSCLC患者82例作為研究對(duì)象，其中男性47例、女性35例，年齡(41～73)歲，平均(52.31±15.04)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)病理切片及TNM分期診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，確診為非小細(xì)胞肺癌。②臨床及隨訪資料完整。③患者及家屬均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書。④入組前未接受放、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤。②心、腎、肝臟等重要器官嚴(yán)重功能障礙。③患有嚴(yán)重精神疾病。④孕期、哺乳期婦女。入組患者根據(jù)腫瘤分化程度分為：高中分化36例、低分化46例；根據(jù)病理類型分為：鱗癌39例、腺癌43例；根據(jù)原發(fā)腫瘤大小分為：T1～T2期64例、T3～T4期18例；根據(jù)TN分期標(biāo)準(zhǔn)可分為：Ⅰ～Ⅱ期60例、Ⅲ期22例；根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

二、主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀(型號(hào)：SLAN-965，上海宏石醫(yī)療有限公司)，RNA提取試劑盒(貨號(hào)：RP2402，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205311，德國(guó)Qiagen公司)，熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：RR820A，大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒(貨號(hào)：ab7310，上海艾博抗貿(mào)易有限公司)，兔抗人MET多克隆抗體(貨號(hào)：ab137654，上海艾博抗貿(mào)易有限公司)羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：A21220，深圳市安提生物科技有限公司)。

三、方法

1 樣本采集

術(shù)中收集NSCLC患者癌組織及癌旁組織(距病灶>5cm)，一部分使用10%福爾馬林浸泡后制成4μm厚切片，用于免疫組織化學(xué)染色；另一部分在液氮中冷凍后放入-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2 組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用qRT-PCR法檢測(cè)NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA樣本，使用qRT-PCR試劑盒配制20μL反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)程序如下:95℃，5min，1循環(huán)；95℃、20s，62℃、36s，70℃、20s，以上40循環(huán)，一個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算MET、TXA2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

3 組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。所得切片在400倍顯微鏡下觀察并采集圖像資料。染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色為MET、TXA2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評(píng)分：①陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<5%記0分，5%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記3分，>75%記4分。②陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。兩者記分相乘為染色指數(shù)，根據(jù)染色指數(shù)分級(jí)：0～4分為低表達(dá)；5～12分為高表達(dá)。

四、隨訪

所有入組患者經(jīng)治療出院后以電話或復(fù)查形式對(duì)其進(jìn)行5年隨訪，每3個(gè)月1次，期間觀察并記錄患者生存情況，隨訪至2019年6月截止，隨訪期間無(wú)失訪患者。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平比較

NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平比較

二、NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)水平比較

如圖1所示，MET、TXA2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。NSCLC組織中MET、TXA2蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

圖1 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)水平比較

表3 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)水平比較

三、NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

NSCLC組織MET、TXA2蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

四、NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

NSCLC組織中MET mRNA與TXA2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(rs=0.413，P<0.001)(見(jiàn)圖2)。

圖2 NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

五、MET、TXA2表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系

經(jīng)Kaplan-Meier生存分析可知，MET高表達(dá)組患者5年累積生存19例，5年總生存率為37.36%；MET低表達(dá)組患者5年累積生存22例，5年總生存率為70.97%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.169，P<0.05)。TXA2高表達(dá)組患者5年累積生存18例，5年總生存率為33.33%；TXA2低表達(dá)組患者5年累計(jì)生存23例，5年總生存率為82.14%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.980，P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 MET、TXA2表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系

六、COX回歸分析

單因素分析顯示，MET、TXA2表達(dá)水平、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度均是影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，MET、TXA2表達(dá)水平和腫瘤分化程度是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表5)。

表5 影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

討 論

近年來(lái)，NSCLC發(fā)病率較高，且患者癥狀不具有典型特征，早期難以被確診，病情易進(jìn)展至中晚期，出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、咳血、轉(zhuǎn)移至其它器官引起病變，嚴(yán)重威脅患者生存及生活質(zhì)量[8]。尋找特異性標(biāo)志物是控制NSCLC病情進(jìn)展、提高患者生存率關(guān)鍵。

MET位于人類第7條染色體7q21-q31區(qū)域，主要表達(dá)于肺、肝、腎、支氣管、胰腺等器官上皮細(xì)胞中，可與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)相互作用，激活磷脂酰肌醇激酶、絲裂原活化蛋白激酶等信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂等生長(zhǎng)過(guò)程[9]。Cho等研究證實(shí)，MET在小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中MET蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與Cho等[10]在小細(xì)胞肺癌中研究結(jié)果相似，提示MET表達(dá)水平升高可能與NSCLC發(fā)生有關(guān)。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，MET過(guò)表達(dá)與乳腺癌腫瘤體積大、腫瘤高分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織MET蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TXA2是由血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等在一定條件下分泌，具有刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用[12]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中TXA2表達(dá)水平明顯升高，提示TXA2水平上調(diào)可能與NSCLC發(fā)生有關(guān)。研究報(bào)道，TXA2在前列腺癌中高表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞染色體重構(gòu)和雄激素活性，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織TXA2蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TXA2蛋白表達(dá)水平上調(diào)可能通過(guò)影響癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移水平，參與NSCLC發(fā)展。

NSCLC組織中MET與TXA2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示MET和TXA2間可能存在相互作用機(jī)制，共同促進(jìn)NSCLC發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。Karolina等人研究發(fā)現(xiàn)，血小板增多可通過(guò)分泌TXA2促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展和不良預(yù)后發(fā)生[14]。Kim等研究表明，胃腫瘤原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中MET均過(guò)表達(dá)，與患者總生存期較短、復(fù)發(fā)率增加有關(guān)，是患者不良預(yù)后標(biāo)志物[15]。本研究結(jié)果顯示，MET、TXA2高表達(dá)組5年總生存率明顯低于MET、TXA2低表達(dá)組，提示MET、TXA2高表達(dá)可能與NSCLC生存率低等不良預(yù)后有關(guān)。單因素分析顯示，MET、TXA2表達(dá)水平、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度均是影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，MET、TXA2表達(dá)水平和腫瘤分化程度是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示MET、TXA2與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系密切，可作為NSCLC患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，與癌旁組織相比，NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，可能與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者相互作用，共同參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。但由于本研究樣本量較少，研究方法較為單一，具體研究機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究。