如克亞木·阿不都沙拉木 古麗巴哈爾·阿不拉合買提 李樹濤 阿布都沙拉木·托合提

耐多藥肺結核是指感染結核分枝桿菌后對利福平耐藥、異煙肼耐藥的肺結核，其主要特點為高治療費、低治愈率及高死亡率，是臨床結核病治療的難題之一[1-2]。據(jù)相關研究證實，其病因與臨床不合理用藥相關，因機體內(nèi)基因突變造成藥物降低對突變菌的作用，故耐藥菌株增多是誘發(fā)耐藥的重要原因[3-4]。結核分支桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，細胞免疫是機體內(nèi)主要的抗結核免疫，而機體內(nèi)T淋巴細胞亞群及其細胞因子與細胞免疫強弱密切相關。因此結核病的研究重點是分析其細胞免疫。經(jīng)查閱發(fā)現(xiàn)Th1/Th2/Treg細胞及相應細胞因子水平在耐多藥結核患者中的研究甚少，因此本研究將探討外周血Th1/Th2/Treg細胞及相應細胞因子水平在耐多藥結核患者中的診斷價值及意義，以期為臨床提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、患者臨床資料

回顧性分析自2016年2月-2020年2月于我院接受治療的肺結核患者99例，分為無耐藥組和耐藥組，其中無耐藥組：肺結核患者共52例，男31例(占比59.62%)，女21例(占比40.38%)，年齡為20～54歲、平均年齡為(34.83±7.21)歲；耐藥組：肺結核患者47例，男27例(占比57.45%)，女20例(占比42.55%)，年齡為19～54歲、平均年齡為(34.62±7.35)歲；另外抽取同期體檢的健康者76例作為健康組：男45例(占比59.21%)，女31例(占比40.79%)，年齡為20～53歲、平均年齡為(34.48±7.19)歲。

三組患者一般資料差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究方案的制定符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關要求。

二、入選標準

納入標準：肺結核根據(jù)《肺結核診斷和治療指南》中的相關標準，耐多藥肺結核根據(jù)2019版《耐多藥肺結核診斷和治療指南》中的相關標準，且經(jīng)X線胸片或胸部CT診斷為肺結核；首次接受治療者；年齡>18歲；未合并其他傳染病病原合并感染者，如乙肝、艾滋病等。

排除標準：合并慢性阻塞性肺疾病、糖尿病或惡性腫瘤者；合并慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等其他慢性感染；近3個月內(nèi)使用過糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物；妊娠期或哺乳期婦女；免疫功能障礙者。

三 實驗方法

1 主要儀器及試劑

DW-86L626超低溫冰箱(生產(chǎn)廠家：海爾特種電器有限公司)；L535R臺式大容量冷凍離心機(生產(chǎn)廠家：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細胞儀；DD-5M低速大容量離心機(生產(chǎn)廠家：湖南湘立科學有限公司)；南京卡米洛生物工程有限公司生產(chǎn)的本研究所需的試劑盒；上?；鄯f生物科技有限公司生產(chǎn)的PBS緩沖液；美國Santa Cruz公司生產(chǎn)的熒光抗體。

2 檢測外周血Th1/Th2/Treg細胞及相應細胞因子水平

所有患者入院后均抽取空腹8h以上肘靜脈血3～5mL，以3500 r/min離心15 min后提取血清50μ放入離心管，分離單個核細胞。采用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司生產(chǎn))測定Th1/Th2/Treg細胞比例：將細胞分為三份，CD4-FITC+IFN-γ-APC抗體標記Th1細胞，CD4-FITC+IL-4-cy5抗體標記Th2細胞，CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3抗體標記Treg細胞，調(diào)整細胞濃度，將100 μL以上熒光抗體加入對應單個核細胞內(nèi)，室內(nèi)避光孵育1 h，沖洗(PBS緩沖液)，將破膜劑加入，再次避光孵育15 min，PBS沖洗后上機收集細胞流式細胞儀進行檢測，檢測過程嚴格按照其說明書進行操作。

Th1細胞因子IFN-γ、Th2細胞因子IL-4及Treg細胞因子IL-10均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測，其操作過程需嚴格根據(jù)說明書進行操作。

3 數(shù)據(jù)分析

用Flow-Check標準熒光微球校正儀器光路，調(diào)整FITC/PE的熒光補償，以CD4/IFN-γ、CD4/IL-4和CD4/CD25/Foxp3分別建立雙參數(shù)直方圖，得出CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-4+和CD4+/CD25+/Foxp3+的比例。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、三組Th1細胞及相應細胞因子水平比較

與對照組相比，耐藥組和無耐藥組患者血清Th1細胞、IFN-γ水平均顯著降低(tTh1=27.652、25.508，PTh1均<0.001；tIFN-γ=31.709、29.309，PIFN-γ均<0.001)，且耐藥組患者血清Th1細胞、IFN-γ水平均顯著低于無耐藥組(tTh1=2.182，PTh1=0.031；tIFN-γ=2.781，PIFN-γ=0.006)(見表1)。

表1 三組Th1細胞及相應細胞因子水平比較

二、三組Th2細胞及相應細胞因子水平比較

與對照組相比，耐藥組和無耐藥組患者血清Th2細胞以及IL-4水平均顯著降低(tTh1=29.457、18.881、17.227，PTh1均<0.001；tIL-4=31.741、16.838、14.995，PIL-4均<0.001)，且耐藥組患者血清Th2細胞以及IL-4水平均顯著低于無耐藥組(tTh2=2.077，PTh2=0.041；tIL-4=2.333，PIL-4=0.022)(見表2)。

三、三組Treg細胞及相應細胞因子水平比較

與對照組相比，耐藥組和無耐藥組患者血清Treg細胞和IL-10水平均顯著降低(tTreg=28.560、14.002，PTreg均<0.001；tIL-10=27.853、21.376，PIL-10均<0.001)，且耐藥組患者血清Treg細胞和IL-10水平均顯著低于無耐藥組(tTreg=2.339，PTreg=0.022；tIL-10=3.395，PIL-10=0.001)(見表3)。

表2 三組Th2細胞及相應細胞因子水平比較

表3 三組Treg細胞及相應細胞因子水平比較

討 論

據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織報告，我國耐多藥肺結核發(fā)病率據(jù)全球第2位，復治肺結核患者具有明顯的耐藥性，同時耐藥性也是結核病防治工作中急需解決的難點及重點問題[5-6]。耐多藥肺結核誘因較多，患者免疫力降低是結核分枝桿菌感染的重要危險因素，且可增加結核分枝桿菌耐藥性[7-8]。因此，通過分析耐多藥肺結核患者免疫水平的變化情況，從而進一步探討其對患者病情影響的的價值及意義，對該疾病的臨床治療尤為重要。

Th1/Th2型細胞因子在抗結核免疫中發(fā)揮重要作用，相關研究顯示，耐多藥結核的主要發(fā)病機制是患者外周血中Th1細胞和Th2細胞降低導致[9-10]。Th1細胞主要抗細胞內(nèi)細菌及調(diào)節(jié)細胞免疫應答，可分泌IFN-γ等細胞因子，增加免疫應答[11]。Th2細胞可分泌白細胞介素IL-4、IL-5等細胞因子，對Th1細胞增殖具有抑制作用，介導體液免疫反應[12]。本研究結果顯示，與對照組相比，耐藥組和無耐藥組患者血清Th1細胞及其細胞因子IFN-γ水平、Th2細胞及其細胞因子IL-4水平以及Treg細胞及其細胞因子IL-10水平均顯著降低(P均<0.001)；耐藥組患者血清Th1細胞及其細胞因子IFN-γ水平、Th2細胞及其細胞因子IL-4水平以及Treg細胞及其細胞因子TGF-β水平均較不耐藥組患者顯著降低(P均<0.05)，表明：耐藥和無耐藥結核患者免疫細胞水平均低于健康對照人群，而耐多藥結核患者免疫細胞水平則較無耐藥組患者更低，以上研究結果與前人研究結果一致。例如，劉鳳娟[13]等學者通過研究提示，肺結核患者體內(nèi)Th1細胞、IFN-γ水平及Th2細胞、IL-4水平明顯低于正常人；余美玲[14]等研究提示，Thl型細胞因子與Th2型細胞因子水平可隨肺結核患者病情變化增高或降低，病情越嚴重則其水平越低反之則相反。Miahipour[15]等研究提示，Th細胞亞群的失衡與耐多藥肺結核的發(fā)生密切相關，特別是Th1細胞及其細胞因子降低。

Treg細胞是一類控制體內(nèi)自身免疫反應性的T細胞亞群，對Th1等所介導的抗結核免疫應答具有仰止作用，當機體內(nèi)Treg細胞及其相關因子不平衡時，會嚴重影響抗結核免疫應答，導致機體免疫功能受到抑制[16]。本研究結果提示，耐藥組與無耐藥組患者血清Treg細胞、IL-10水平明顯低于健康組，并且以耐藥組患者血清Treg細胞、IL-10水平最低(P>0.05)，提示結核病患者免疫功能明顯受到抑制，而耐多藥結核患者免疫抑制程度則比無耐藥患者更為嚴重，與前人研究結果相似，如王國戧[17]等學者通過研究提示，在結核性胸膜炎患者體內(nèi)Treg細胞水平明顯降低，且低于正常人水平。另外本研究時間有限所納入樣本量較少，且隨訪時間較短，故進一步研究時，應在擴大樣本量的同時對耐多藥結核患者免疫細胞中的Th17細胞及其相關因子進行分析，且增加隨訪時間，深入研究論證。

總之，結核患者外周血中Th1細胞、IFN-γ，Th2細胞、IL-4以及Treg細胞、IL-10水平則高于健康人，特別是耐多藥結核患者上述細胞因子變化更大，說明耐多藥結核患者中免疫功能受損較為嚴重，Treg細胞及其細胞因子可能成為臨床治療耐多藥結核患者的新方向。