任小軍 蘇春紅 陳永剛 移志剛 董平 劉文忠 丁界先 王一農(nóng)

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州730000；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，寧夏 銀川750001

隨著人類生活方式的改變以及社會(huì)老齡化進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥已成為威脅中老年人，特別是絕經(jīng)后女性健康和生活質(zhì)量的全球性健康問題，其危害程度僅次于心血管疾?。?］。骨質(zhì)疏松癥為骨量的減少和骨骼結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致骨骼完整性的下降和骨折的增加，成骨細(xì)胞骨形成功能衰退和破骨細(xì)胞骨吸收功能活躍是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要病理機(jī)理。血液中相關(guān)細(xì)胞因子的檢測對于骨質(zhì)疏松癥的療效判斷、作用機(jī)理探索具有重要意義［2-3］。研究表明［4-5］，枸杞多糖（LBP）能增加雙側(cè)卵巢摘除致骨質(zhì)疏松癥雌性SD 大鼠股骨干重、骨密度值，對骨質(zhì)疏松癥大鼠有治療作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測骨質(zhì)疏松癥模型建立成功的SD 大鼠給藥90 天時(shí)血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和NOS 的水平，探討LBP 對卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥的療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供潔凈級3 月齡雌性SD 大鼠50 只，體重260～310g，平均280g，無生育和哺乳史，隨機(jī)分為5 組，每組10 只。分別是SHAM 組（空白對照組）、OVX 組（切除雙側(cè)卵巢去勢對照組）、E2 組（切除雙側(cè)卵巢去勢+己烯雌酚干預(yù)組）、L 組（切除雙側(cè)卵巢去勢+中劑量LBP 干預(yù)組）和H 組（切除雙側(cè)卵巢去勢+高劑量LBP 干預(yù)組）。

1.2 試藥與儀器 LBP（寧夏啟元藥業(yè)有限公司，純度99.99%批號：GF08002-2）；己烯雌酚（北京四環(huán)制藥二廠，批號：H09030476）；Rat TGF-β ELISA Kit（上海船夫生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Lunar Prodigy型雙能X 線骨密度儀；wi1205 大鼠固定器（北京東西儀科技有限公司）；LXJ-Ⅱ普通低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；高速自動(dòng)離心機(jī)（上海貝克曼公司）；放射免疫計(jì)數(shù)器（美國PE 公司）；分光光度儀Z-5000（日立，日本）；Model550 酶標(biāo)儀（日本BIO-MED 公司）。

1.3 方法

1.3.1 骨質(zhì)疏松模型的建立。所有動(dòng)物采用3%戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射，麻醉后，俯臥位固定于專用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺，剪去手術(shù)區(qū)域局部體毛，碘伏消毒，鋪無菌巾單，分別取大鼠背部雙側(cè)正中旁切口，逐層分離顯露雙側(cè)卵巢及輸卵管，SHAM 組實(shí)驗(yàn)大鼠只切除與模型組同質(zhì)量的雙側(cè)卵巢周圍少許脂肪組織，其他四組大鼠（OVX 組、E2 組、L 組和H 組）先結(jié)扎雙側(cè)輸卵管及伴行血管，然后切除雙側(cè)卵巢，生理鹽水沖洗后逐層縫合，常規(guī)飼養(yǎng)8 周，骨密度儀掃描各組大鼠腰椎骨密度，證實(shí)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型建立成功。

1.3.2 給藥方案。L 組和H 組大鼠分別給予LBP 10mg/（kg·d）和40mg/（kg·d）5mL 灌胃，E2 組實(shí)驗(yàn)大鼠給予己烯雌酚0.05mg/（kg·d）皮下注射，SHAM 組和OVX 組用5mL 生理鹽水灌胃，各組給藥90 天。

1.3.3 標(biāo)本采集及檢測方法。在給藥90 天，各組實(shí)驗(yàn)SD 大鼠采用3%戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射麻醉，心臟采血5mL，經(jīng)低溫離心（3500r/min）10min，取血漿分裝，用夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定TGF-β1 的含量、比色法測定NOS 的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，則采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)；反之，進(jìn)行數(shù)據(jù)變換或秩和檢驗(yàn)，選取SNK 檢測方法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠腰椎骨密度對比 OVX 組、E2 組、L 組和H 組大鼠骨密度值低于SHAM 組（P＜0.05），但OVX 組、E2 組、L 組和H 組四組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠腰椎骨密度值（）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠腰椎骨密度值（）

注：與SHAM 組比較，▲P＜0.05

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2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中TGF-β1 水平比較 藥物干預(yù)90 天后，SHAM 組、E2 組、L 組和H 組大鼠血清中TGF-β1 含量水平高于OVX 組（P＜0.05），而SHAM組、E2 組、L 組和H 組間TGF-β1 含量水平的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中TGF-β1 水平比較（±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中TGF-β1 水平比較（±s）

注：與SHAM 組比較，▲P＜0.05；與OVX 比較，△P＜0.05；與E2 組比較，◇P＜0.05；與L 組比較，◆P＜0.05；與H 組比較，※P＜0.05

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2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中NOS 水平比較 藥物干預(yù)90 天后，SHAM 組、E2 組、L 組和H 組大鼠血清中NOS含量水平高于OVX 組（P＜0.05），而SHAM 組、E2 組、L組和H 組間NOS 含量水平的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

最新中國居民骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示［6］，我國50 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%，65 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率則高達(dá)32%，其中男女比例約為1∶5，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國50 歲以上人群的重要健康隱患［7］，給國家醫(yī)療系統(tǒng)造成較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究表明，雌激素缺乏在兩性的骨質(zhì)疏松中都占主導(dǎo)性的地位［8］，但使用外源性雌激素替代已證明有副作用［9-10］，因此，激素替代治療預(yù)防骨質(zhì)疏松癥并不被廣泛推薦。

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中NOS 水平比較（）

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中NOS 水平比較（）

注：與SHAM 組比較，▲P＜0.05；與OVX 比較，△P＜0.05；與E2 組比較，◇P＜0.05；與L 組比較，◆P＜0.05；與H 組比較，※P＜0.05

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各種參與破骨細(xì)胞分化的介質(zhì)已被研究作為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生和治療的重要可能靶點(diǎn)，TGF-β1 是骨基質(zhì)中含量最豐富的抑制骨吸收、促進(jìn)骨生成，對骨重建發(fā)揮重要作用的多功能細(xì)胞因子，Tadahiro Tokunaga等［11］研究顯示，TGF-β1 可通過阻斷核因子受體激活劑（NF）-κB 配體（RANKL）p65基因的移位，進(jìn)而抑制人類破骨細(xì)胞活化和骨吸收。TGF-β1 還可經(jīng)多種途徑促進(jìn)人類成骨細(xì)胞的骨形成作用，Zhang Z 等［12］研究認(rèn)為，TGF-β1 通過磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白/S6 激酶靶點(diǎn)1（PI3K/AKT/mTOR/S6K1）信號通路促進(jìn)人類成骨細(xì)胞的骨誘導(dǎo)形成作用；Elsafadi M 等［13］研究顯示，TGF-β1 通過重組肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架而刺激人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化。一般認(rèn)為，雌激素對骨的影響可通過NO 介導(dǎo)［14］；在骨中，NO 是由骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或破骨細(xì)胞內(nèi)的NOS酶合成的，NO 的主要功能是刺激細(xì)胞內(nèi)定位的鳥苷環(huán)化酶形成第二信使cGMP，cGMP 進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)的一系列化學(xué)反應(yīng)完成其固有功能，通過刺激NO-cGMP通路可抑制成骨細(xì)胞的凋亡活性，同時(shí)刺激破骨細(xì)胞內(nèi)的凋亡活性增加，進(jìn)而使骨形成大于骨破壞，發(fā)揮骨重建的作用［15］。

本研究顯示，LBP 可提高去勢大鼠血清中NOS 和TGF-β1 的水平，進(jìn)而通過NO 和TGF-β1 介導(dǎo)的分子機(jī)制通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)骨重建代謝的作用；同時(shí)，LBP 中劑量組和高劑量干預(yù)組大鼠血清中NOS、TGF-β1 的水平與觀察組和己烯雌酚組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明LBP 能對骨質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述，LBP 可通過上調(diào)大鼠血清中NOS 和TGF-β1 的水平干預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠骨質(zhì)疏松癥的骨代謝過程，但關(guān)于LBP 防治骨質(zhì)疏松癥的更多機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。